版纳微型猪近交系猪→人异种器官移植免疫排斥关键候选基因CMAH和B4GALNT2的功能鉴定

The initial barrier to the xenotransplantation from pigs to people is hyperacute rejection (HAR), with α1,3 galactose (α1,3Gal) being the major xenogenic antigen involved in HAR. The body still reject the grafts when pigs organs free from α1,3Gal are transplanted into baboons, suggesting that there are other heterologous antigens in pigs. Our previous study found that CMAH and B4GALNT2 genes, involved in synthesis of NeuGc and Sda xenoantigens, respectively, are associated with the immune rejection in xenotransplantation. The project is to aim at investigating if B4GALNT2 and CMAH could catalyze the corresponding antigens’ synthesis by studying Chinese Banna Mini-pig Inbred Line, using Western Blotting and Immunohistochemistry to analyze CMAH and B4GALNT2 protein expression profiles and celluar localization, HPLC to observe the NeuGc and Sda antigen content after knockdown or overexpression of CMAH and B4GALNT2 genes, LDH-ELISA to examine human-serum-mediated cytotoxicity against NeuGc and Sda antigen, and FACS to explore the types and content of human serum immunoglobulins binding to NeuGc and Sda antigen. And ultimately, the study is to establish the function of CMAH and B4GALNT2 genes in the xenotransplantation from pigs to people, and to lay the foundation for the establishment of xenotransplantation in a porcine model.

猪→人异种器官移植的主要屏障是超急性排斥反应（HAR），α1,3半乳糖（α1,3Gal）是引起HAR的主要抗原。将清除了α1,3Gal的猪器官移植给狒狒，仍会发生排斥反应，提示在猪体内还存在其他异种抗原。我们前期研究发现CMAH和B4GALNT2基因与异种移植免疫排斥相关，它们分别参与异种抗原NeuGc和Sda的合成。本项目拟以版纳微型猪近交系为研究对象，采用WB和IHC分析CMAH和B4GALNT2的蛋白表达谱和细胞定位，HPLC检测干扰和过表达CMAH和B4GALNT2基因后NeuGc和Sda抗原含量的变化，LDH-ELISA检测NeuGc和Sda抗原对人血清介导的细胞毒性，FACS检测NeuGc和Sda抗原结合的人血清免疫球蛋白的种类和含量，最终确定CMAH和B4GALNT2能否催化相应抗原的合成，鉴定其在猪→人异种器官移植排斥中的功能，为建立适用于异种器官移植的猪模型奠定基础。

在猪-人异种器官移植中，α-1,3半乳糖（α-1,3-Gal）是引发超急性排斥反应的主要抗原，但在猪的细胞表面还存在其他多种非半乳糖抗原也能引发免疫排斥反应，而CMAH和B4GALNT2就是可以催化其他抗原合成的两种酶。本研究以版纳微型猪近交系（BMI）为研究材料，通过RT-PCR获得了CMAH和B4GALNT2基因cDNA序列，采用绿色荧光蛋白亚细胞定位确定了CMAH和B4GALNT2两种蛋白主要在细胞质中发挥作用；组织切片免疫荧光结果显示这两种蛋白在3种免疫相关组织中的表达丰度均为脾脏＞淋巴结＞扁桃体，且同时也表明主要在细胞质中表达。进一步，构建了干扰载体Sh-CMAH和Sh-B4GALNT2，过表达载体pcDNA3.1-CMAH和pcDNA3.1-B4GALNT2，并成功转染细胞，利用qPCR和WB筛选出了干扰效率最高的Sh-CMAH-1和Sh-B4GALNT2-2，并发现干扰CMAH的PK15细胞组唾液酸含量极显著低于空载体对照组，表明CMAH表达下调影响了唾液酸的合成；过表达CMAH的HEK293细胞组唾液酸含量极显著低于空载体对照组，同时检测到的IgM抗体荧光强度仅极显著高于空载体组，而IgG荧光强度同时极显著高于空载体组和空白对照组；过表达B4GALNT2组细胞中检测到的IgM和IgG荧光强度均极显著高于空载体组和空白对照组。CMAH基因的IgG荧光强度增量显著高于IgM荧光强度增量说明CMAH基因的PK15细胞产生的异种抗原性主要由人血清IgG抗体而不是IgM抗体产生；B4GALNT2基因的IgG荧光强度增量与IgM荧光强度增量无显著差异，说明B4GALNT2基因的异种抗原性由人血清中的IgG抗体和IgM抗体共同产生。进一步检测发现，过表达CMAH组细胞中检测到的GS-IB4荧光极显著低于对照组；过表达B4GALNT2组细胞中检测到的GS-IB4荧光强度极显著低于对照组，而极显著高于空载体组，说明过表达CMAH产生的异种抗原是由NeuGc抗原引起而不是α1,3Gal引起，但不能确认过表达B4GALNT2的细胞中产生的异种抗原是否由Sda引起。本研究探索了CMAH和B4GALBT2基因对异种移植抗原合成的调控，为鉴定这两个基因在猪→人异种器官移植免疫排斥反应中的功能以及建立适用于异种器官移植的猪模型提供试验资料。

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