杂合抗菌抗病毒肽设计及其工程菌构建和作用效应研究

This study is conducted to address the bottleneck in sustainable development of animal husbandry, including drug resistance, antibiotic residual, environmental pollution and failure for treatment of diseases caused by mutated and non-typical virus. The antimicrobial peptides sequences in UniProt database were employed to design novel hybrid antimicrobial and antivirus peptides (AMVP). These AMVPs are chemical synthesized and screened for antibacterial and antivirus activity. High efficient engineering bacterial or yeast strains are constructed to heterologous express the AMVP with broad spectrum and strong activity. The new AMVP is purified and its biological characteristics (e.g. antibacterial and antivirus activity, stability), mechanism of antimicrobial activity, and effects on toxicity and immunity of liver and kidney tissue cells are investigated. This study will provide new insight into the systematic and general technology and methodology of molecular design, screening, expression, purification, function evaluation and mode of action of novel hybrid antimicrobial peptides and bioactive peptides. Finally, this study will offer a new strategy for development of antibiotic alternatives and safe veterinary drugs to guarantee the safety of food and human health.

针对阻碍畜牧业可持续发展的瓶颈问题，如长期超量使用抗生素产生的耐药性、药残和环境污染问题，以及由变异、非典型病毒等引发的多种畜禽疾病而造成的巨大经济损失。本项目利用生物信息联合数据库中的抗菌肽序列资源和本实验室研究基础，设计新型杂合抗菌抗病毒肽（AMVP），人工化学合成并筛选出高效杂合AMVP，然后分别构建出高效表达杂合AMVP的工程菌，然后进行高效表达和分离纯化，并进一步研究其生物学特性（抗菌、抗病毒、稳定性等）和抗菌抗病毒机理以及对肝、肾等组织细胞和免疫功能的影响，为研究新型杂合抗菌肽类乃至其它生物活性肽的分子设计、筛选、表达、分离纯化、功效评价、作用机制研究提供系统和公用的新思路、新技术和新方法等，最终为研发新型杂合肽类抗生素替代品、绿色生物药物等开辟一条新途径、以确保人类的食品安全和健康。

抗菌肽是通过核糖体途径产生的具有抗菌活性的多肽和蛋白类物质。相对于通过酶促反应形成的抗生素，抗菌肽具有安全性高、无残留、高稳定、特异性抑杀病原菌等优良特性，是抗生素替代品的理想选择。本研究利用 APD 等多个数据库中抗菌肽相关信息资源并结合本实验室研究基础，以具有高效抗菌和（或）抗病毒活性的抗菌肽 melittin、 cecropin A、 LL-37、 HP（ 2-20）、 lacticin Q 为母源肽，设计、筛选并合成了六条具有潜在抗菌活性的候选杂合肽。通过对母源肽和候选杂合肽的生物活性研究，筛选得到具有高效抗菌抗病毒活性的抗菌抗病毒杂合肽 M-L 和 C-L。杂合肽 M-L和 C-L 抑菌活性较母源肽提高 2-64 倍，杀菌速度得到不同程度的改善；溶血试验发现，杂合肽均未表现出明显的溶血活性，溶血性较母源肽降低了 1-16 倍。本项目还对M-L和 C-L在两种不同表达系统的表达方法、生物学特性和免疫调节效果研究。结果表明，成功在毕赤酵母和大肠杆菌中进行了C-L和 M-L的高效表达。在毕赤酵母表达中，分别将杂合肽C-L和 M-L基因与pPICZaA载体连接，构建重组载体，转化毕赤酵母GS115，重组杂合肽经过纯化，获得了纯度90%以上的重组杂合肽，产量分别为50.84 和45.5 mg/L。且C-L的毕赤酵母工程菌经过规模培养及条件优化，达到规模生产水平。在大肠杆菌表达中，分别将C-L和 M-L基因克隆到pET SUMO质粒构建表达载体，转化大肠杆菌BL21 (DE3)，使细菌素与SUMO融合表达，经IPTG诱导，融合细菌素实现了胞内表达，通过酶切及两轮Ni-NTA Sepharose色谱柱纯化获得了纯度90％以上的重组细菌素，产量可分别高达23、17.54 mg/L。除此之外，本项目对C-L进行了抗炎特性的研究,结果表明，杂合肽C-L能够有效的抑制LPS诱导的炎症因子表达量，并能通过NFKB及MAPK信号通路调节机体免疫反应。以上研究结果表明，本项目成功进行了重组杂合肽在两种载体的高效表达，且具有良好的抑菌活性、较宽的pH、高温耐受性和抗炎效应。C-L和 M-L高效表达和纯化为重组细菌素或抗菌肽的高效表达和纯化提供了具体的表达系统、表达方法、参数和理论依据，而且为抗生素替代品的开发提供了新思路、新方法、新技术。

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