本项目在本研究团队已有基础上，向猪PSC中转染pIRES2-AcGFP1-Wnt3a真核表达载体，检测其对猪PSC细胞增殖及凋亡的影响；另外通过外源加入小分子抑制剂BIO，检测其对猪PSC增殖及向胰岛素分泌细胞分化的作用；此外，向猪PSC中转染TRE-Dual-Wnt3a/AcGFP，建立强力霉素(doxycycline，DOX)可调控表达Wnt3a的细胞株，检测Wnt3a的表达细胞增殖及通路下游靶分子表达的影响，揭示其对猪PSC增殖的调控机制；除此之外，我们还探索了小分子Conophylline对猪PSC、胰岛细胞团细胞的增殖及向胰岛细胞团诱导分化的作用及机理，所取得的主要研究进展和成果如下：.1.体外添加1µmol/L BIO后，可通过Wnt-βcatenin信号通路促进猪PSC的增殖，但对其向胰岛素分泌细胞分化的过程中无显著效用，说明BIO能够保持猪PSC未分化的状态。.2.通过构建Wnt3a的真核表达载体，并将其转染入猪PSC中，发现其可促进细胞增殖，并且可以抑制细胞的凋亡，这种效应是通过激活经典Wnt信号通路，由此激活下游关键靶基因的转录而引起，这对体外维持猪PSC的状态及数量具有重要意义。.3. 通过向猪PSC转入Tet-on系统的诱导表达载体和调控表达载体后，成功构建Dox诱导Wnt3a表达的猪PSC，并证明Wnt3a的表达受Dox处理时间和剂量调控，通过向细胞中添加Dox后，发现细胞增殖可明显增强，这些效应是通过Wnt3a的表达而引起。该系统的成功建立，将为我们后续研究Wnt通路在猪PSC增殖及分化机理提供一个实时动态的检测平台。.4. 我们通过实验证明，小分子Conophylline可促进猪胰腺干细胞、胰岛细胞团细胞的增殖，这种作用是通过PI3K通路介导的，这为提高猪PSC向胰岛素分泌细胞分化效率提供了一条新的途径。.5. 我们还构建了小鼠R-spondin1真核表达载体，并对其进行鉴定，将其瞬时转染到HEK-293细胞系中检测其表达，为进一步研究Wnt信号通路在猪胰腺干细胞中的作用机制奠定基础。. 本项目全面完成预定研究内容，实现了预期研究目标。共发表5篇SCI论文，国内核心期刊1篇；协作培养硕士生1名、博士生1名，在读硕士生2名；参加国际学术会议1次，国内学术会议2次，并作口头报告1次。