融合蛋白GTH在大鼠精子转基因中的应用研究

按照课题研究计划首先进行了融合蛋白GTH基因构建、表达与纯化；完成了融合蛋白GTH可溶性表达，工程菌发酵罐发酵，建立了简便高效的纯化工艺，获得了98%纯度的目的蛋白，通过正交实验确定了融合蛋白体外与DNA 结合的最佳结合条件并确定了融合蛋白质结合DNA的能力达到1：10，有力保障了课题的顺利实施。.大批量制备了抗HphA的单克隆抗体并建立了检测GTH的多种免疫学方法，包括ELISA、western blot和免疫组化等方法。建立了半定量RT-PCR和western blot方法用于检测细胞和精子中GnRH受体基因水平和蛋白质表达水平，筛选出了受体水平最高的细胞株进行DNA转运和绿色荧光测定。通过GTH重组蛋白作用于Hela细胞的免疫组化研究证明融合蛋白可以将超嗜热古菌组蛋白组分高效转运至细胞内。同时免疫组化实验还证明GTH融合蛋白可以将超嗜热古菌组蛋白组分转运至精子内，使精子细胞呈现的褐色阳性。利用GTH融合蛋白可以高效地将绿色荧光蛋白质粒转运至细胞和精子内，细胞在被作用12小时后50%以上细胞出现绿色荧光，且对细胞无任何损伤作用。GTH-DNA复合物转染精子的实验表明：融合蛋白显著提高了外源基因进入精子的效率。进行了多次SD大鼠转基因动物实验操作，但由于实验方法和操作技术不足，以及东北气候条件限制，母鼠未能人工授精成功，尚未获得阳性转基因动物，下一步将着力开展转基因动物的实验研究。.通过课题研究发表了1篇SCI论文：PLOS ONE2015.10（11）影响因子3.234，申报了一项发明专利；培养毕业了2名硕士研究生。