PPE68抗原修饰的ΔRpfB卡介苗预防结核分枝杆菌感染的实验研究

结核病是位居单一病原引起病人死亡的严重传染病之首，卡介苗（BCG）用于预防结核病已有80多年的历史，但其免疫效果为0-80%不等。RpfB是结核分枝杆菌（Mtb）分泌的五个复活促进因子之一，它具有抑制固有免疫系统抗菌活性的作用，与Mtb逃脱免疫防御而引起的慢性感染和潜伏感染有关。PPE68是BCG缺失的Mtb保护性抗原成分。本课题着眼于改造BCG：得到新型重组BCG (ΔRpfB/ PPE68 BCG)活疫苗，并从体内实验研究其免疫原性和抗Mtb免疫应答的特征。本课题构建了重组BCG所需的质粒及鉴定：包括了PPE68抗原原核表达质粒、PPE68抗原真核表达质粒、IPR1真核表达质粒、PPE68/IPR1共表达真核质粒、RpfB基因敲除质粒；完成重组BCG构建：包括了PPE68/OriM重组BCG、IPR1/OriM重组BCG、PPE68/IPR1/OriM重组BCG、ΔRpfB /OriM重组BCG;将构建好的DNA疫苗和重组BCG免疫BALB／c 小鼠，并探讨重组疫苗的毒性、免疫原性和免疫保护作用及其相应机制。同时，对PPE68的功能进行深入的研究，首次在真核细胞系中表达该原核蛋白，原核表达的PPE68蛋白纯化后免疫动物获得特异性抗体；分别使用PPE68蛋白和抗PPE68蛋白抗体作为诊断试剂去检测结核病患者血清中相应的抗体或抗原。结果：DNA疫苗中pBPO(pBud+PPE68+OriM)组和pBIPO(pBud+Ipr1+PPE68+OriM)组小鼠血清中IgG2α、IFN- γ水平明显高于其他组；且pBIPO(pBud+Ipr1+PPE68+OriM)组IL-12水平也高于其他组；重组BCG中，PPE68/OriM重组BCG组小鼠血清的IgG2α水平提高，CD4+ ／CD8+Th比值下降，提示产生有效地Th1型细胞免疫应答；但是PPE68/OriM重组BCG组和OriM重组BCG组IFN-γ和IL-12水平含量虽然明显高于生理盐水组，但低于BCG组(P<0．05) 。重组的PPE68蛋白在肺外病患者的血清学检查中，敏感性为98.2%，特异性为79.7%，准确度为88.1%，该方法快速有效，有望成为肺外结核病诊断的辅助诊断。