整合素avβ3介导细胞骨架重塑促进PEDV侵入宿主细胞的分子机制
批准号：
32102660
项目类别：
青年科学基金项目（C类）
资助金额：
30.0 万元
负责人：
李春秋
依托单位：
学科分类：
兽医病毒学
结题年份：
2024
批准年份：
2021
项目状态：
已结题
项目参与者：
李春秋
项目摘要
结项摘要
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中文摘要
猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于α冠状病毒属成员，是引起仔猪死亡的“第一杀手”，给我国养猪业带来严重的经济损失。目前，PEDV细胞受体尚未得到确证，其侵入机制仍然处于探索研究阶段。我们前期研究发现，猪整合素avβ3能增强PEDV的黏附和内化；PEDV能激活整合素avβ3影响细胞骨架蛋白表达水平。研究显示，细胞骨架重塑与病毒侵入宿主细胞密切相关。我们推测，整合素avβ3介导的细胞骨架重塑为PEDV入侵宿主细胞创造了有利的细胞表面微环境。为了验证该科学假设，本研究拟通过建立PEDV病毒粒子示踪平台及整合素avβ3、细胞骨架可视化细胞平台，明确PEDV黏附过程中整合素avβ3激活及其构象变化、揭示PEDV内化过程中整合素avβ3介导细胞骨架重塑及其动态变化，阐明PEDV通过整合素avβ3介导细胞骨架重塑促进病毒侵入的分子机制，为PEDV侵入新机制揭示以及抗病毒药物设计提供理论基础。
英文摘要
Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), which belonging to the genus Alphacoronavirus, is the leading killer of piglet and has led to enormous economic losses within the pork industry in China. Currently, PEDV's receptor has not been confirmed, and its entry mechanism has not been fully elucidated. Previous studies showed that integrin avβ3 promoted PEDV replication via enhancing PEDV adhesion and internalization; PEDV could activate integrin avβ3 and affect the expression levels of cytoskeleton proteins. The current research shows that cytoskeletal rearrangement is associated with virus entry into host cells. Thus, we speculate that the integrin αvβ3-induced cytoskeleton rearrangement creates favorable cell surface microenvironment for PEDV entry. To validate the hypothesis, we construct the model of single virus tracking and the visualization platform of integrin αvβ3 and cytoskeleton, verify the conformational changes in the integrin avβ3 during PEDV adhesion, and reveal the dynamic changes in cytoskeletal induced by integrin avβ3 during PEDV internalization. Resulting data will provide theoretical basis for the clarification of novel infection mechanism and designing of antiviral agents of PEDV.
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病，给我国养猪业乃至全球的养猪业带来严重危害。病毒与宿主细胞蛋白之间复杂的相互作用，是病毒感染的关键步骤，一直是病毒学领域研究的热点问题。目前，围绕PEDV侵入机制开展了一系列研究，但仍然存在许多的瓶颈问题和争议，鉴于此，阐明病毒感染的机制，能为抗病毒设计提供理论基础。.为明确整合素αvβ3能增强PEDV在IPEC-J2细胞的复制作用，利用整合素αvβ3激活剂和抑制剂通过荧光定量PCR和IFA验证整合素αvβ3参与PEDV感染。细胞肌动蛋白抑制剂CytoD处理后PEDV感染IPEC-J2细胞和Vero E6细胞中微丝的免疫荧光明显减少；细胞微管蛋白抑制剂Noco处理后PEDV感染IPEC-J2细胞和Vero E6细胞中微管的免疫荧光无明显变化。.为明确整合素结合肽抗PEDV作用，本研究通过细胞毒性测定、半数有效浓度的测定、Western blot测定、TCID50测定、间接免疫荧光等技术方法，分析整合素结合肽在IPEC-J2细胞上对PEDV复制的影响。结果显示，40 μM浓度以下的整合素结合肽对IPEC-J2细胞无细胞毒性；低浓度的四种RGD、IET、LDV、IDS具有明显的抗病毒作用；RGD、IET、LDV、IDS能显著降低PEDV ORF3 mRNA相对水平、PEDV N蛋白表达水平以及PEDV子代病毒滴度，IFA试验结果也表明四种整合素结合肽对PEDV增殖有抑制作用。.评价整合素结合肽作为预防药物的抗PEDV感染结果显示，在体内攻毒后72 h，PEDV对照组仔猪存活率为0%，而整合素结合肽RGD、IET、LDV、IDS和四种肽混合组存活率分别为50%、100%、50%、25%和25%；整合素结合肽组仔猪小肠病理变化轻微；整合素结合肽组仔猪肛门拭子和空肠病毒载量显著低于PEDV感染。.为了进一步明确整合素结合肽对攻毒仔猪的治疗影响，对攻毒后仔猪进行给药处理，结果显示攻毒60 h后，PEDV攻毒组仔猪全部死亡，RGD、IDS、IET、LDV和四种肽混合组治愈率为83.3%、66.7%、50%、66.7%和100%。整合素结合肽可以减轻攻毒仔猪临床症状、肠道病理损伤；整合素结合肽组仔猪空肠病毒载量显著低于PEDV感染。综上，本课题为PEDV抗病毒肽的后续应用研究奠定基础。
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