白菜花粉特异表达的两个类成束阿拉伯半乳糖蛋白基因的功能和相互关系分析

The elaborately sculpted pollen wall plays important role not only in the process of pollen development and fertilization, but also in the protection of gamete, male sterility and pollen-stigma recognition. Fasciclin-like arabinogalactan proteins (FLAs), a subfamily of arabinogalactan proteins (AGPs) which are complex hyperglycosylated glycoproteins, are believed to be involved in pollen wall formation. Here, functional characterization and relationship investigation of two pollen-specific FLAs genes, BcFLA14a and BcFLA14b, are explored via the highly specific gene silencing by the artificial microRNAs technology in Brassica campestris ssp. chinensis. Artificial microRNAs will be designed to target individual genes and both. Morphological, cytological, palynological and genetical analysis will be performed on the transgenic plants to achieve the objectives. Meanwhile, based on characterization of an Arabidopsis mutant generated by T-DNA insertional mutagenesis of FLA14, BcFLA14a or BcFLA14b will be over-expressed in fla14 mutant background, to test if they could partially/fully compensate for a loss of FLA14 function. These researches will do a great favor on understanding the role and function of pollen-expressed/specific FLAs genes, provide help to establish detailed framework of pollen wall development, and get us know more about the molecular mechanism of male sterility.

植物花粉壁是花粉的重要结构，不仅在花粉发育和受精过程中起重要作用，还和雄配子存活、雄性不育、花粉-柱头识别等直接相关。阿拉伯半乳糖蛋白（AGPs）家族中的类成束阿拉伯半乳糖蛋白（FLAs）亚家族在花粉壁发育过程中发挥重要作用。本项目以在白菜花粉中特异表达的2个FLAs基因BcFLA14a和BcFLA14b为对象，利用能高效引起体内靶基因沉默的人工microRNA技术对其进行单基因抑制和双基因共抑制，通过形态学、细胞学、孢粉学、遗传学水平观测分析转基因植株，鉴定其功能，比较它们在花粉壁发育过程中的作用模式异同；同时通过比较拟南芥FLA14相应的功能缺失突变体表型并基因互补试验，研究三者之间的相互关系。通过上述研究对在花粉表达甚至花粉特异表达的AGPs基因，尤其是已有成员被报道确实参与花粉壁发育的FLAs亚家族成员的功能进行深入解析，有助于建立花粉壁发育的详细框架和系统认识雄性不育的分子机理。

花粉发育和花粉管生长是非常复杂的植物生命过程，受到高度复杂的基因网络协同调控。植物花粉壁是花粉的重要结构，不仅在花粉发育和受精过程中起着重要作用，还和雄配子存活、雄性不育、花粉-柱头识别等直接相关。阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan proteins, AGPs）基因家族编码一类广泛存在于高等植物体内的富含脯氨酸的高度糖基化的蛋白分子。研究表明，AGP基因家族中的类成束阿拉伯半乳糖蛋白（fasciclin-like AGPs, FLAs）亚家族在花粉发育、花粉壁形成和花粉管生长过程中发挥着重要作用。深入认识花粉发育和花粉管生长相关基因的功能，将为充分揭示种子植物雄配子发育的分子机制提供理论依据和技术支持。本项目以白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa ssp. chinensis）‘矮脚黄’核不育（‘Aijiaohuang’ genic male sterility, ajhGMS）两用系‘Bcajh97-01A/B’为材料，对三个FLA基因BcFLA14a、BcFLA14b和BcFLA14c以及它们在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的同源基因AtFLA14进行序列结构分析，结果发现它们的核酸序列高度相似，均为FLA编码基因；通过时空表达分析，证实这四个FLA基因都是花粉后期发育相关的基因，在花粉粒和花粉管中特异表达，但是它们之间的相对表达量并不完全一致；亚细胞定位结果显示它们所编码的蛋白广泛分布在胞内和胞外，证实它们都为分泌蛋白。同时，利用拟南芥AtFLA14 T-DNA插入突变体和过表达转基因植株进行功能验证，发现AtFLA14基因与花粉内壁发育、花粉萌发相关，并推测AtFLA14可能通过参与花粉内壁纤维素的沉积过程影响到花粉的发育过程。采用RNAi干涉技术对BcFLA14a、BcFLA14b、BcFLA14c表达共抑制进行功能验证，结果表明白菜中FLA14的表达受抑制并不会影响植株的正常生长发育，但高湿条件下花粉异常萌发。通过上述研究对在花粉表达甚至花粉特异表达的AGP基因，尤其是已有成员被报道确实参与花粉发育的FLA亚家族成员的功能进行深入解析，有助于建立花粉发育的详细框架和系统认识雄性不育的分子机理。

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