RNA结合蛋白TTP靶向抑制LncRNA-SNHG1保护帕金森病多巴胺神经元的机制研究

我们明确了TTP与LncRNA SNHG1 之间的关系，我们发现 PD 神经元模型中，TTP 表达保护性升高。过表达 TTP 后进行转录本测序，发现 LncRNA SNHG1 表达明显下降。敲低 TTP 表达后，LncRNA SNHG1 表达升高，这表明 TTP 是 LncRNA SNHG1 的上游调控因子，进一步利用生物信息学分析发现，LncRNA SNHG1 全基因序列上存在多个 TTP 可能结合位点。利用慢病毒过表达 LncRNA SNHG1 后，过表达 TTP 所产生的神经元保护作用减弱，神经元死亡增加，提示 TTP 可能通过调控 LncRNA SNHG1 发挥神经保护效应。此外，我们通过对代谢组学分析进一步探讨了LncRNA SNHG1在PD中的变化，并且验证了这一过程是通过影响线粒体的变化产生的。我们在MPP+处理的细胞中敲低SNHG1，随后进行代谢组学分析，锁定了差异代谢产物亮氨酸，并在小鼠模型中进行了验证。同时我们研究了亮氨酸缺乏对线粒体功能的影响。透射电子显微镜观察MPP+处理后MN9D细胞的线粒体形态，可以发现线粒体外观出现了明显的变化，并在补充外源性亮氨酸后得到了改善。通过装载JC-1探针来测定线粒体的膜电位（MMP），在MPP+处理后，MN9D细胞线粒体的膜电位下降；剥夺亮氨酸后，细胞的线粒体膜电位进一步降低。我们也采用一系列体内实验验证了上述实验结果。我们在MPP+诱导的MN9D细胞中鉴定出了 40 个潜在的 SNHG1 结合蛋白，然后通过GO分析这些蛋白主要定位于线粒体。KEGG分析显示，参与亮氨酸代谢的酶 MCCC1 的得分最高。随后我们通过WB实验证实了MCCC1在线粒体中分布。为了进一步确定 MCCC1 是否可以与 SNHG1 结合，我们进行了 RNA 免疫沉淀（RIP）检测。结果表明， MCCC1 蛋白共轭物中可检测到 SNHG1；我们还进一步通过免疫荧光评估 SNHG1 和 MCCC1 在 PD 细胞模型和动物模型中的亚细胞共定位情况。结果显示，SNHG1和MCCC1蛋白共定位在线粒体中。我们还对SNHG1如何影响亮氨酸关键代谢酶MCCC1的蛋白本身进行了探究。在 MPP+ 处理的 MN9D 细胞中，MCCC1 的表达呈时间和浓度依赖性升高。综上所述，我们明确了亮氨酸在帕金森疾病中的重要作用，为后期帕金森病人的治疗提供了新的思路