Rat Brain Protein Kinase C: Purification, Antibody Production, and Quantification in Discrete Regions of Hippocampus
Rat Brain Protein Kinase C: Purification, Antibody Production, and Quantification in Discrete Regions of Hippocampus
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大鼠脑蛋白激酶 C：海马离散区域的纯化、抗体产生和定量
DOI：
--
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发表时间：
1989
影响因子：
4.7
通讯作者：
M. Iadarola
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
B. Roth;J. P. Mehegan;D. Jacobowitz;F. Robey;M. Iadarola
摘要：蛋白激酶C（PKC）是一种钙和磷脂依赖性激酶，在大鼠脑中高度富集，在信号转导过程中发挥作用。我们通过二乙基氨基乙基纤维素、苯基琼脂糖和鱼精蛋白琼脂糖的三柱程序将大鼠脑PKC纯化至均一，产率为16%，最终比活性为9，600 pmol [3 H]佛波醇-12，13-二丁酸酯结合/mg蛋白。纯蛋白质由80和78千道尔顿的双重峰组成。针对β型PKC合成肽序列（RAKIGQGTKAPEEKTANTISK）制备的兔抗体对PKC显示出高特异性和灵敏度，并且仅识别78千道尔顿形式的PKC。将大鼠海马亚区的微穿孔（直径300 μm）溶解在十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液中，在SDS-10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并转移到硝酸纤维素上。PKC通过125 I-蛋白A放射自显影法可视化，并通过光密度测定法定量。PKC在海马CA 1区锥体细胞层的含量最高（0.43 ± 0.04 OD），在CA 3区和CA 4区锥体细胞层的含量最低（分别为0.11 ± 0.02和0.085 ± 0.006 OD）。这些结果证明了制备针对PKC结构域的抗体的简单方法。我们还描述了一个程序，用于量化离散的大脑区域中的PKC的相对量。
Abstract: Protein kinase C (PKC), a calcium‐ and phospholipid‐dependent kinase, is highly enriched in rat brain, where it may function in signal transduction processes. We purified rat brain PKC to homogeneity by a three‐column procedure of diethylaminoethyl‐cellulose, phenyl‐Sepharose, and protamine‐agarose with a yield of 16% and a final specific activity of 9,600 pmol of [3H]phorbol‐12,13‐dibutyrate bound/mg of protein. The pure protein consisted of a doublet of 80 and 78 kilodaltons. Rabbit antibodies prepared against a β‐type PKC synthetic peptide sequence (RAKIGQGTKAPEEKTANTISK) showed high specificity and sensitivity for PKC and recognized only the 78‐kilodalton form of PKC. Micropunches (300 μm in diameter) of rat hippocampal subregions were solubilized in sodium dodecyl sulfate (SDS) sample buffer, electrophoresed on SDS–10% polyacrylamide gels, and transferred to nitrocellulose. PKC was visualized by 125I‐protein A autoradiography and quantified by densitometry. The highest concentrations of PKC were found in the CA1 pyramidal cell layer (0.43 ± 0.04 OD), with the lowest amounts in the CA3 and CA4 pyramidal cell layers (0.11 ± 0.02 and 0.085 ± 0.006 OD, respectively). These results demonstrate a simple way of preparing antibodies against domains of PKC. We also describe a procedure for quantifying the relative amounts of PKC in discrete brain regions.
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