Multiplex in situ hybridization within a single transcript: RNAscope reveals dystrophin mRNA dynamics.
Multiplex in situ hybridization within a single transcript: RNAscope reveals dystrophin mRNA dynamics.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0239467
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发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
Piercy RJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Hildyard JCW;Rawson F;Wells DJ;Piercy RJ
肌营养不良蛋白在维持肌肉健康方面起着至关重要的作用，但低mRNA表达，漫长的转录时间和传统原位杂交（ISH）方法的局限性意味着肌营养不良蛋白转录的动力学仍然知之甚少。RNAscope是一种高灵敏度的ISH方法，可以多重化，允许以亚细胞分辨率检测单个转录物分子，不同的靶mRNA被分配给不同的荧光团。相反，我们使用靶向肌营养不良蛋白mRNA的5'和3'区域的探针，在单个转录物内多重化。我们的方法表明，这种方法可以揭示健康和疾病中的转录动态，以定量方式解析新生肌萎缩症转录本和输出的成熟mRNA（后者在营养不良的肌肉中不存在，但在治疗干预后恢复）。我们发现，即使在健康的肌肉中，不成熟的肌营养不良蛋白mRNA也占主导地位（占总数的60-80%），这意味着成熟转录本的半衰期明显短于转录所需的时间：在转录本水平上，供应可能超过需求。我们的研究结果提供了独特的时空洞察这个长的转录本的行为（与治疗方法的影响），并进一步表明这种修改后的多重ISH方法非常适合长基因，提供了一个非常容易处理的手段来揭示复杂的转录动力学。
Dystrophin plays a vital role in maintaining muscle health, yet low mRNA expression, lengthy transcription time and the limitations of traditional in-situ hybridization (ISH) methodologies mean that the dynamics of dystrophin transcription remain poorly understood. RNAscope is highly sensitive ISH method that can be multiplexed, allowing detection of individual transcript molecules at sub-cellular resolution, with different target mRNAs assigned to distinct fluorophores. We instead multiplex within a single transcript, using probes targeted to the 5’ and 3’ regions of muscle dystrophin mRNA. Our approach shows this method can reveal transcriptional dynamics in health and disease, resolving both nascent myonuclear transcripts and exported mature mRNAs in quantitative fashion (with the latter absent in dystrophic muscle, yet restored following therapeutic intervention). We show that even in healthy muscle, immature dystrophin mRNA predominates (60–80% of total), with the surprising implication that the half-life of a mature transcript is markedly shorter than the time invested in transcription: at the transcript level, supply may exceed demand. Our findings provide unique spatiotemporal insight into the behaviour of this long transcript (with implications for therapeutic approaches), and further suggest this modified multiplex ISH approach is well-suited to long genes, offering a highly tractable means to reveal complex transcriptional dynamics.
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DOI：
10.1073/pnas.1119057109
发表时间：
2012-01-17
影响因子：
11.1
作者：
Chen, Huimin;Meisburger, Steve P.;Pollack, Lois
通讯作者：
Pollack, Lois
影响因子：
3.5
作者：
GORECKI, DC;MONACO, AP;BARNARD, PJ
通讯作者：
BARNARD, PJ
影响因子：
3.5
作者：
DSOUZA, VN;MAN, NT;RAY, PN
通讯作者：
RAY, PN
DOI：
10.1016/j.physa.2012.09.022
发表时间：
2013-03-01
影响因子：
3.3
作者：
Chi, Qingjia;Wang, Guixue;Jiang, Jiahuan
通讯作者：
Jiang, Jiahuan
影响因子：
5.6
作者：
Kawaguchi T;Niba ETE;Rani AQM;Onishi Y;Koizumi M;Awano H;Matsumoto M;Nagai M;Yoshida S;Sakakibara S;Maeda N;Sato O;Nishio H;Matsuo M
通讯作者：
Matsuo M