Molecular beacons with intrinsically fluorescent nucleotides.
Molecular beacons with intrinsically fluorescent nucleotides.
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DOI：
10.1093/nar/gkl134
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发表时间：
2006-04-04
影响因子：
14.9
通讯作者：
Turro NJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Martí AA;Jockusch S;Li Z;Ju J;Turro NJ
我们报告了一种新型分子信标（MB-FB）的设计、合成和表征，该分子信标使用荧光碱基（FB）2-氨基嘌呤（AP）和吡咯-dC（P-dC）作为荧光团。由于这些 FB 的量子产率取决于与互补靶标的杂交，因此通过将 FB 位点专门放置在 MB 内来调整 MB-FB 的荧光特性，这样与互补序列的杂交对于 AP 从单链切换为双链，对于 P-dC 反之亦然。当在 310 nm（AP 的最大吸收）激发时，MB-FB 产生 8.5 的比率荧光增量（在存在和不存在互补序列的情况下，P-dC 相对于 AP 的荧光发射）。通过进一步优化激发 (325 nm)，比率荧光增加至 14。荧光寿命也会受到目标添加的影响，导致长寿命成分从 6.5 ns 变化到 8.7 ns（Exc. 310 nm，Em. 450 nm）。在 450 nm 处监测的热变性曲线（P-dC 发射）显示 MB-FB 协同变性，熔化温度为 53°C。与其靶标杂交的 MB-FB 的热变性曲线显示在 53°C 时荧光显着降低，这与从双链螺旋到无规卷曲 DNA 的转变一致。
We report the design, synthesis and characterization of a novel molecular beacon (MB-FB) which uses the fluorescent bases (FB) 2-aminopurine (AP) and pyrrolo-dC (P-dC) as fluorophores. Because the quantum yield of these FB depend on hybridization with complementary target, the fluorescent properties of MB-FB were tuned by placing the FB site specifically within the MB such that hybridization with complementary sequence switches from single strand to double strand for AP and vice versa for P-dC. The MB-FB produces a ratiometric fluorescence increase (the fluorescence emission of P-dC over that of AP in the presence and absence of complementary sequence) of 8.5 when excited at 310 nm, the maximum absorption of AP. This ratiometric fluorescence is increased to 14 by further optimizing excitation (325 nm). The fluorescence lifetime is also affected by the addition of target, producing a change in the long-lived component from 6.5 to 8.7 ns (Exc. 310 nm, Em. 450 nm). Thermal denaturation profiles monitored at 450 nm (P-dC emission) show a cooperative denaturation of the MB-FB with a melting temperature of 53°C. The thermal denaturation profile of MB-FB hybridized with its target shows a marked fluorescence reduction at 53°C, consistent with a transition from double stranded helix to random coil DNA.
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