ATP-independent DNA unwinding by the adenovirus single-stranded DNA binding protein requires a flexible DNA binding loop.
ATP-independent DNA unwinding by the adenovirus single-stranded DNA binding protein requires a flexible DNA binding loop.
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腺病毒单链 DNA 结合蛋白的 ATP 依赖性 DNA 解旋需要灵活的 DNA 结合环。
DOI：
--
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发表时间：
1998
影响因子：
5.6
通讯作者：
P. C. van der Vliet
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
J. Dekker;P. Kanellopoulos;J. A. van Oosterhout;G. Stier;P. Tucker;P. C. van der Vliet
腺病毒DNA结合蛋白(DBP)与单链DNA协同结合，刺激DNA复制的启动和延长。DBP通过连接到相邻分子的C末端臂形成蛋白质细丝。这种多聚化是DBP在伸长过程中解离不依赖于ATP的DNA的驱动力。DBP的另一个保守部分形成一个非结构化的柔性环，可能直接参与与DNA的接触。通过在不扭曲整个DBP结构的情况下选择合适的缺失突变体，研究了C末端臂和柔性环对单链DNA结合动力学和DNA复制的影响。利用表面等离子激元共振，我们证明了蛋白质的两个部分都是高亲和力结合所必需的。C-末端臂的缺失导致了一个极其不稳定的DBP-ssDNA复合体，这表明了多聚化的重要性。柔性环也是DBP-ssDNA复合体最佳稳定性所必需的，这提供了额外的证据，表明该区域形成了DBP的ssDNA结合表面的一部分。这两个缺失突变体仍然能够刺激DNA复制的开始，但在支持延长方面存在缺陷，这可能是由于两个突变体的DNA解卷活性降低所致。令人惊讶的是，含有这两个突变体的混合物确实会刺激伸长。将纯化的突变蛋白混合后形成的混合丝与单链DNA的亲和力高于均一的突变丝。这些结果为C末端臂和柔性环在复制过程中具有不同的解旋功能提供了证据。我们提出了DBP非依赖于ATP的DNA解离模型。通过C-末端臂的多聚化是形成饱和置换链的蛋白质细丝所必需的。DBP单体对单链DNA的高亲和力以及随后复制叉的局部不稳定需要灵活的环。
The adenovirus DNA binding protein (DBP) binds cooperatively to single-stranded (ss) DNA and stimulates both initiation and elongation of DNA replication. DBP forms protein filaments via a C-terminal arm that hooks into a neighbouring molecule. This multimerization is the driving force for ATP-independent DNA unwinding by DBP during elongation. Another conserved part of DBP forms an unstructured flexible loop that is probably directly involved in contacting DNA. By making appropriate deletion mutants that do not distort the overall DBP structure, the influence of the C-terminal arm and the flexible loop on the kinetics of ssDNA binding and on DNA replication was studied. Employing surface plasmon resonance we show that both parts of the protein are required for high affinity binding. Deletion of the C-terminal arm leads to an extremely labile DBP-ssDNA complex indicating the importance of multimerization. The flexible loop is also required for optimal stability of the DBP-ssDNA complex, providing additional evidence that this region forms part of the ssDNA-binding surface of DBP. Both deletion mutants are still able to stimulate initiation of DNA replication but are defective in supporting elongation, which may be caused by the fact that both mutants have a reduced DNA unwinding activity. Surprisingly, mixtures containing both mutants do stimulate elongation. Mixing the purified mutant proteins leads to the formation of mixed filaments that have a higher affinity for ssDNA than homogeneous mutant filaments. These results provide evidence that the C-terminal arm and the flexible loop have distinct functions in unwinding during replication. We propose the following model for ATP-independent DNA unwinding by DBP. Multimerization via the C-terminal arm is required for the formation of a protein filament that saturates the displaced strand. A high affinity of a DBP monomer for ssDNA and subsequent local destabilization of the replication fork requires the flexible loop.
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