益母草碱激活p62/Nrf2/HO-1信号通路抑制肾小管上皮细胞铁死亡的作用机制
益母草碱激活p62/Nrf2/HO-1信号通路抑制肾小管上皮细胞铁死亡的作用机制
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DOI：
10.19540/j.cnki.cjcmm.20221115.401
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发表时间：
2023
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
田瑞敏
中科院分区：
文献类型：
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作者：
吴爱君;陈乃清;黄丽华;程冉;王晓婉;黎创;毛炜;黄清明;徐鹏;田瑞敏
为探讨益母草碱(leonurine, Leo)对erastin诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)铁死亡的保护作用及其潜在机制,在体外构建erastin诱导的HK-2细胞铁死亡模型,检测Leo对铁死亡细胞活力、细胞状态、铁死亡相关指标及相关信号通路蛋白的影响。首先,体外培养HK-2细胞,CCK-8法检测10、20、40、60、80、100 μmol·L~(-1)的Leo对正常HK-2细胞活性的影响,以此确定Leo的安全给药剂量范围;用铁死亡经典诱导剂erastin诱导铁死亡细胞模型并筛选出合适的造模浓度;CCK-8法检测Leo(20、40、80 μmol·L~(-1))及阳性药铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1,1、2 μmol·L~(-1))对铁死亡模型细胞活性的影响,同时在相差显微镜下观察细胞形态学的变化。其次,通过Western blot法检测核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)的入核激活情况,并筛选后续机制研究的最佳浓度;进一步用透射电镜观察铁死亡发生的特征性显微形态学改变,应用流式细胞术检测活性氧(reactive oxygen species, ROS)变化,使用还原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)测定试剂盒检测GSH含量。最后,采用Western blot法定量检测各组谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)、通路蛋白p62及Nrf2下游蛋白血红素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)的表达,探讨Leo对HK-2铁死亡调控作用的具体机制。结果显示,Leo在浓度为10~100 μmol·L~(-1)时对正常HK-2细胞活性无影响,表明该浓度范围的药物对细胞无明显毒副作用;HK-2细胞活性随着铁死亡诱导剂erastin浓度的增高而降低,5 μmol·L~(-1) erastin能够显著诱导HK-2细胞发生铁死亡;与模型组相比,20、40、80 μmol·L~(-1)的Leo呈剂量依赖性提高HK-2细胞活性,并且能有效改善细胞形态;80 μmol·L~(-1) Leo能显著上调HK-2细胞核中Nrf2的表达。进一步研究表明,Leo可以显著改善erastin造成的铁死亡特征性显微结构损伤,抑制细胞内ROS的释放,升高GSH含量,促进Nrf2向细胞核内移位,增强GPX4,显著上调p62、HO-1蛋白的表达。综上所述,Leo对erastin诱导的人肾小管上皮细胞铁死亡具有保护作用,其机制可能是通过激活p62/Nrf2/HO-1信号通路实现抗氧化应激从而抑制铁死亡。