Zinc-finger recombinase activities in vitro.
Zinc-finger recombinase activities in vitro.
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DOI：
10.1093/nar/gkr652
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发表时间：
2011-11
影响因子：
14.9
通讯作者：
Stark WM
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Prorocic MM;Wenlong D;Olorunniji FJ;Akopian A;Schloetel JG;Hannigan A;McPherson AL;Stark WM
锌指重组酶（ZFR）是包含连接至锌指DNA结合结构域的丝氨酸重组酶催化结构域的嵌合蛋白。ZFR可以被定制以促进不同“Z位点”处的位点特异性重组，所述不同“Z位点”各自包含侧翼为锌指结构域结合基序的中心核心序列。在这里，我们表明，纯化的ZFR催化有效的高特异性相互重组之间的Z-位点在体外。没有检测到场外活动。在不同的反应条件下，ZFR可以催化Z位点特异性的双链DNA切割。ZFR在大肠杆菌中和体外的重组活性高度依赖于Z位点核心序列的长度。我们表明，这种长度效应表现在反应步骤之前，形成重组体（结合，突触和DNA裂解）。ZFR蛋白本身的设计也是影响活性的关键变量。在催化结构域和锌指结构域之间具有非常短（2个氨基酸）的肽连接的ZFR在体外具有高活性，而具有非常长的接头的ZFR的重组效率较低并且对Z位点长度的变化较不敏感。我们讨论了这些现象的原因，以及它们对ZFR实际应用的影响。
Zinc-finger recombinases (ZFRs) are chimaeric proteins comprising a serine recombinase catalytic domain linked to a zinc-finger DNA binding domain. ZFRs can be tailored to promote site-specific recombination at diverse ‘Z-sites’, which each comprise a central core sequence flanked by zinc-finger domain-binding motifs. Here, we show that purified ZFRs catalyse efficient high-specificity reciprocal recombination between pairs of Z-sites in vitro. No off-site activity was detected. Under different reaction conditions, ZFRs can catalyse Z-site-specific double-strand DNA cleavage. ZFR recombination activity in Escherichia coli and in vitro is highly dependent on the length of the Z-site core sequence. We show that this length effect is manifested at reaction steps prior to formation of recombinants (binding, synapsis and DNA cleavage). The design of the ZFR protein itself is also a crucial variable affecting activity. A ZFR with a very short (2 amino acids) peptide linkage between the catalytic and zinc-finger domains has high activity in vitro, whereas a ZFR with a very long linker was less recombination-proficient and less sensitive to variations in Z-site length. We discuss the causes of these phenomena, and their implications for practical applications of ZFRs.
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影响因子：
14.9
作者：
Olorunniji FJ;He J;Wenwieser SV;Boocock MR;Stark WM
通讯作者：
Stark WM
DOI：
10.1073/pnas.1533177100
发表时间：
2003-07-22
影响因子：
11.1
作者：
Akopian, A;He, JY;Stark, WM
通讯作者：
Stark, WM
影响因子：
3.7
作者：
Proudfoot C;McPherson AL;Kolb AF;Stark WM
通讯作者：
Stark WM
DOI：
10.1073/pnas.022039799
发表时间：
2002-04-02
影响因子：
11.1
作者：
Santoro, SW;Schultz, PG
通讯作者：
Schultz, PG
影响因子：
3.6
作者：
Burke, ME;Arnold, PH;Stark, WM
通讯作者：
Stark, WM