Quantifying Reversible Surface Binding via Surface-Integrated Fluorescence Correlation Spectroscopy.
Quantifying Reversible Surface Binding via Surface-Integrated Fluorescence Correlation Spectroscopy.
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DOI：
10.1021/acs.nanolett.8b00875
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发表时间：
2018-05-09
期刊：
影响因子：
10.8
通讯作者：
Schwille P
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Mücksch J;Blumhardt P;Strauss MT;Petrov EP;Jungmann R;Schwille P
我们提出了一种简单而通用的单分子为基础的方法，用于准确地确定表面或表面结合受体的结合率。为了定量荧光标记分子的可逆表面附着，我们对以前的全内反射荧光相关光谱(TIR-FCS)和基于相机的检测方案进行了改进。与大多数现代的TIR-FCS应用相比，我们完全忽略了横向的空间信息。相反，我们对空间集成信号执行相关分析，有效地将照明表面积转换为测量体积。除了提供高的表面选择性，我们的新方法还解决了在广泛的时间范围内平衡的缔合和解离速率。我们选择了荧光标记的单链DNA与表面固定的DNA折纸结构的互补手柄的瞬时杂交作为一种可靠且具有良好特性的测试系统。我们改变了双链中的碱基对数量，产生了从数百毫秒到几十秒的不同结合时间，使我们能够量化各自的表面亲和力和结合率。
We present a simple and versatile single-molecule-based method for the accurate determination of binding rates to surfaces or surface bound receptors. To quantify the reversible surface attachment of fluorescently labeled molecules, we have modified previous schemes for fluorescence correlation spectroscopy with total internal reflection illumination (TIR-FCS) and camera-based detection. In contrast to most modern applications of TIR-FCS, we completely disregard spatial information in the lateral direction. Instead, we perform correlation analysis on a spatially integrated signal, effectively converting the illuminated surface area into the measurement volume. In addition to providing a high surface selectivity, our new approach resolves association and dissociation rates in equilibrium over a wide range of time scales. We chose the transient hybridization of fluorescently labeled single-stranded DNA to the complementary handles of surface-immobilized DNA origami structures as a reliable and well-characterized test system. We varied the number of base pairs in the duplex, yielding different binding times in the range of hundreds of milliseconds to tens of seconds, allowing us to quantify the respective surface affinities and binding rates.
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