绵羊精子赤道膜蛋白片段1(SPESP1)的克隆、原核表达及纯化
绵羊精子赤道膜蛋白片段1(SPESP1)的克隆、原核表达及纯化
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DOI：
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.023
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发表时间：
2015
期刊：
影响因子：
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通讯作者：
邢万金
中科院分区：
文献类型：
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作者：
马媛媛;程飞跃;邢万金
【目的】：克隆绵羊Spesp1并表达，得到纯化的融合蛋白GST-SPESP1蛋白，为之后进一步研究SPESP1功能奠定基础。【方法】：以绵羊睾丸组织总cDNA为模板，根据GenBank公布的绵羊基因组序列设计引物，PCR扩增得到Spesp1 cDNA，构建原核表达重组载体pGEX-Spesp1，将其转化到E.coli BL21中表达,并优化其表达条件，利用SDS-PAGE切胶纯化法得到纯化的融合蛋白，用Western-blot鉴定所得融合蛋白。【结果】：经测序，克隆得到的Spesp1 cDNA序列与GenBank中预测的cDNA序列对比有两个碱基不同，并造成一个氨基酸的差异。在E.coli BL21中成功表达重组融合蛋白，其最优表达条件为：37℃、4h、0.005% IPTG终浓度，SDS-PAGE和Western-blot中，融合蛋白位于大约64 kDa处并可以被抗GST和抗羊SPESP1的抗体识别，这与预计相符，表明融合蛋白构建成功。【结论】：成功纯化得到GST-SPESP1融合蛋白，为SPESP1在精卵细胞膜融合中的功能性研究奠定了基础。