Molecular and Microscope Analysis of Dictyostelium Microtubule Plus End Complexes and Their Role in Microtubule/Cell Cortex Interactions

在一种微管相关蛋白质中，有一种特殊的微管加端接韦尔登。这是一个高动力学的超分子复合物，其分子量为梅尔3 MDa。微管加末端复合物可使微管的内皮细胞与皮质结合变得更好，而微管与皮质结合蛋白Aktin的相互作用也可通过膜蛋白来实现。这位沃冈人讲述了一个关于Zellkernmigration、Spindelorientierung和Gerichteter Zellmotilität的角色。我们将使用Dictyosteobacterium Amöben作为模型，通过对Zellmigration和Gute Zugänglichkeit的遗传操作来实现。Mit DdEB 1，DdCP 224和Dynein-中间体具有三个Mikrotubuli-plus-End-Komplexes特征标记。在此，我们将DdGlued和DdLIS 1，即p150 glued（= Dynaktin 1）bzw的Dictyosteoporosis同源物进行比较。des Miller-Dieker Lissenzephalie蛋白LIS 1。在Säugerzellen中，蛋白质和微管神经元的补充作用被削弱，并在微管神经元与皮质神经元的相互作用中表现出一种独特的作用。在此之后，我们发现，在泽伦的帮助下，人们对微型管组织中心（MTOC）的职能和定位问题的认识是最好的。Unser Projekt soll die Rolle von DdLIS1 und DdGlued bei diesem Vorgang klären.我们对SPP 1128的第一个20年的研究是一个基于蛋白质的局部化过程，并通过分析其动态特性来获得更好的Zellen寿命，这是一个基于Lichtmikroskopie的方法。平行地，我们计划通过对缺失、缺失和非表达的研究，对DdLIS 1和DdGlued进行功能特性分析。因此，我们将DdLIS 1和DdGlued结合在一起，形成细胞溶质复合物，用于生化分析。 总结：越来越多的微管相关蛋白质已被证明在微管的正端特异性地积累，在那里它们形成大小超过3 MDa的高度动态的超分子复合物。微管加端复合物似乎是需要通过介导微管尖端与皮质肌动蛋白以及与膜蛋白的相互作用来捕获微管尖端在皮质部位。这一过程在核迁移、纺锤体定向和定向细胞运动中起着重要作用。我们使用Dictyosteobacteriumamoeobacterium作为模型，因为他们表现出快速的趋化细胞迁移，很容易受到遗传操纵。利用DdEB 1、DdCP 224和动力蛋白中间链，我们已经确定了微管加末端复合物的三个标记。在这里，我们打算专注于DdGlued和DdLIS 1，Dictyosteoprotein同源的p150 glued（= dynactin 1）和米勒-迪克尔Lissencephaly蛋白LIS 1，分别。在哺乳动物细胞中，两者都存在于微管正末端，并且似乎在微管尖端与细胞皮质的相互作用中起重要作用。我们的数据表明，这种皮质的相互作用可以确定迁移的方向和微管组织中心（MTOC）在迁移细胞的定位。我们的项目应该阐明DdLIS 1和DdGlued在这个问题上的作用。在SPP 1128的前2年期间，我们的目标是对这两种蛋白质进行详细的亚细胞定位，并使用最先进的光学显微镜技术对其在运动细胞中的动态行为进行实时分析。在平行，我们的目标是在DdLIS 1和DdGlued通过分析缺失，敲除和过/低表达突变体的功能特性。此外，我们打算在生物化学水平上研究含有DdLIS 1和DdGlued的胞质复合物。

Bei einer wachsenden Zahl Mikrotubuli-assoziierter Proteine konnte eine spezifische Konzentrierung an Mikrotubuli-plus-Enden gezeigt werden. Dort bilden sie einen hochdynamischen supramolekularen Komplex einer Größe von mehr als 3 MDa aus. Der Mikrotubuli-plus-End-Komplex wird vermutlich für das Verankern der Mikrotubulispitzen an cortikalen Bindungsstellen benötigt, wobei er Wechselwirkungen sowohl mit cortikalem Aktin als auch mit Membranproteinen vermittelt. Dieser Vorgang spielt eine wesentliche Rolle bei der Zellkernmigration, der Spindelorientierung und gerichteter Zellmotilität. Wir verwenden Dictyostelium Amöben als Modell, da diese sich durch schnelle Zellmigration und gute Zugänglichkeit für genetische Manipulationen auszeichnen. Mit DdEB1, DdCP224 und der Dynein-Intermediärkette haben wir bereits drei Marker des Mikrotubuli-plus-End-Komplexes charakterisiert. Hier konzentrieren wir uns aber auf DdGlued und DdLIS1, die Dictyostelium Homologen von p150glued (= Dynaktin 1) bzw. des Miller-Dieker Lissenzephalie proteins LIS1. In Säugerzellen wurden beide Proteine an den plus-Enden der Mikrotubuli nachgewiesen und scheinen eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung von Mikrotubulispitzen mit dem Zellcortex zu spielen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, daß solche cortikalen Wechselwirkungen die Wanderungsrichtung und die Positionierung des Mikrotubuli-Organisationszentrums (MTOC) in amöboiden Zellen bestimmen könnten. Unser Projekt soll die Rolle von DdLIS1 und DdGlued bei diesem Vorgang klären. Unsere Ziele innerhalb der ersten Zweijahresperiode des SPP1128 sind eine eingehende subzelluläre Lokalisation beider Proteine und die Analyse ihres dynamischen Verhaltens in beweglichen lebenden Zellen, unter Anwendung der fortschrittlichsten Methoden der Lichtmikroskopie. Parallel, planen wir eine funktionelle Charakterisierung von DdLIS1 und DdGlued durch die Untersuchung entsprechender Deletions-, Null- und Über/Unterexpressionsmutanten. Außerdem, wollen wir DdLIS1 und DdGlued enthaltende cytosolische Komplexe auf biochemischer Ebene analysieren. Summary: A growing number of microtubule-associated proteins have been shown to accumulate specifically at the plus ends of microtubules where they form a highly dynamic supramolecular complex with a size of more than 3 MDa. The microtubule plus end complex seems to be required for the capture of microtubule tips at cortical sites by mediating interactions of microtubule tips with cortical actin as well as with membrane proteins. This process plays a major role in nuclear migration, spindle orientation and directional cell movements. We use Dictyostelium amoebae as a model since they exhibit fast chemotactic cell migration and are easily susceptible to genetic manipulation. With DdEB1, DdCP224 and the dynein intermediate chain, we have already characterised three markers for the microtubule plus end complex. Here we intend to focus on DdGlued and DdLIS1, the Dictyostelium homologues of p150glued (= dynactin 1) and the Miller-Dieker Lissencephaly protein LIS1, respectively. In mammalian cells, both are found at microtubule plus ends and seem to play an important role in the interaction of microtubule tips with the cell cortex. Our data suggest that such cortical interactions could determine the direction of migration and the positioning of the microtubule-organizing centre (MTOC) in migrating cells. Our project should shed light on the role of DdLIS1 and DdGlued in this issue. Our goals within the first 2-year period of the SPP1128 are a detailed subcellular localisation of the two proteins and live analysis of their dynamic behaviour in motile cells using most advanced light microscopic techniques. In parallel, we aim at a functional characterisation of DdLIS1 and DdGlued by analysis of deletion, knockout and over/underexpression mutants. Furthermore, we intend to examine cytosolic complexes containing DdLIS1 and DdGlued at the biochemical level.