Elucidation of the biogenesis mechanism of amine dehydrogenase by development of a low-cytotoxicity genome editing technique for bacteria

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本研究では、タンパク質の翻訳後修飾反応により形成されるビルトイン型キノン補酵素、システイントリプトフィルキノン（CTQ）を有するキノヘムプロテイン・アミン脱水素酵素（QHNDH）を対象とした。特に、最後まで未解明のままになっているCTQの生成機構を明らかにすることで、多段階の翻訳後修飾反応によるQHNDHの生合成プロセスを統合的に解明することと、QHNDH生産菌であるParacoccus denitrificansに適用可能な細菌の低細胞毒性ゲノム編集技術を確立することも目的とした。2022年度は、広宿主域ゲノム編集用プラスミドの構築を中心に研究を実施した。プラスミドベクターとして広宿主域のpBBR122およびpRK415を用いた。Cas9遺伝子は約5000 bpと大きいが、5分割した各断片をpUC19にクローニングした後、Golden Gate Assembly法により再結合すると同時にベクターに挿入した。各断片をクローンごとに改変してから再結合が可能で、複数遺伝子の融合が必要なプラスミドでも無理なく構築できることを確認した。次に、IPTGまたは無水テトラサイクリンの培地への添加により広宿主で発現誘導可能なゲノム編集用プラスミドを構築した。まずは大腸菌に導入し、塩基編集法およびプライム編集法によるlacZ遺伝子の編集を試みたところ、ゲノムに意図する変異を導入できることを確認した。一方、P. denitrificansでの誘導時には、これらプロモーター活性が低いことが判明したため、プロモーターおよびオペレータ配列の最適化を現在進めている。今後は、決定した最適配列に置き換えたプラスミドをP. denitrificansに導入し、qhp遺伝子に変異を導入しQHNDHの翻訳後修飾機構の解析に用いる予定である。