Engineering Temperate Bacteriophages for Induced Secretion of Proteins and Peptides by Oral Streptococcus Mitis

摘要： 口腔内细菌种群的共生不仅在维护口腔健康方面发挥着举足轻重的作用。 口腔粘膜，但也有助于寻找有吸引力的药物靶点，用于诱导多种治疗性物质分子的分泌，例如。 多肽/蛋白质疗法或其他免疫原适用于口服疫苗。研究表明，这是通过基因工程进行的。 在无菌动物体内接种共生蛋白后，可以产生具有治疗作用的相关蛋白质，例如。 免疫原可以诱导粘膜抗体的产生。然而，这些抗体的临床翻译是活的。 治疗方法面临许多障碍，包括：(I)难以取代现有的与人类共生的群体。 经过改造的变种，包括(Ii)安全方面的担忧，以及与经过改造的变种有关的问题；(Iii)关于表征、储存和运输的问题。 处理活细菌的处理。特别是在没有接受过广泛治疗的患者身上进行粪便移植的例外情况。 抗生素是一种治疗方法，目前还没有活的细菌被用作临床环境中的一种主要治疗方法。在这项新的提议中，我将寻求帮助。 开发一种新的替代策略，允许对现有的共生种群进行直接和修改。具体而言，是 我将设计一种细菌病毒，也就是噬菌体，以便从基因上改变细菌和细菌的共生种群。 粘膜表面​in原位​。噬菌体不存在对人类的毒性或致病性，因此是非常有效的。 转导载体具有高度的特异性。然而，到目前为止，几乎所有噬菌体的开发都集中在噬菌体的开发上。 关于使用​裂解噬菌体​来杀死特定的致病菌(即噬菌体，作为一种新的抗微生物类别)，。 此外，对温带​​噬菌体进行工程改造以进一步修饰其蛋白表达和分泌的工作也做得很少。 共生细菌简介。这是今年F32培训和拨款计划的主要研究目标之一，目的是为了更好地示范。 这一概念的证据是，经过基因工程的噬菌体可以有效地将遗传物质转移到共生体。 细菌。在目标1中，我将从不同的S​链球菌和Mitis​菌株中分离出三个温带噬菌体菌株。 将一个新的基因片段(Tag-rfp)引入到其基因组中，并对其在转导S​的过程中的潜在效力进行了评估。​是分离到的。 从人类唾液到流式细胞术。Aim-2将这种新方法扩展到提高模型的显示能力和分泌能力。 治疗性分子。在使用最强大的噬菌体载体的同时，我还将整合与基因相关的模型蛋白。 细菌的分泌/展示标签在很大程度上衡量了这些重要蛋白质将不会被细菌或在网上展示的人所分泌。 同样的人类基因是从​S.mitis​.获得的，在目标3中，使用了诺知菌的小鼠，然后接种了人类基因​。S.mitis​，我将。 量化基因工程噬菌体诱导的口腔粘膜和胃肠粘膜中分泌的蛋白质的总量。 这些颗粒以及对这些蛋白质的抗体反应呈现在转导的​S.mitis​的表面上。 这将为进一步研究温带噬菌体的潜在用途提供重要的科学见解，以进一步修改栖息地的共生种群。 提供特定的蛋白质和治疗方法以及免疫原。

ABSTRACT  Commensal bacterial populations in the oral cavity not only play a pivotal role in the maintenance of healthy  oral mucosa, but also makes for attractive targets for induced secretion of therapeutic molecules, such as  peptide/protein therapeutics or immunogens for oral vaccines. Studies have shown that genetically engineered  commensals inoculated in germ­free animals can produce therapeutically relevant proteins, such as  immunogens that elicit mucosal antibody production. However, clinical translation of these these live­bacterial  therapies faces many hurdles, including (i) difficulty in displacing existing commensal populations with the  engineered variants, (ii) safety concerns with the engineered variants, and (iii) characterization, storage and  handling of live bacteria.  With the exception of fecal transplants in patients who have received extensive  antibiotics therapy, no live bacteria are currently used as a therapy in clinical setting.  In this proposal, I seek to  develop an alternative strategy that allows direct modification of existing commensal populations.  Specifically,  I will engineer bacterial viruses, or bacteriophages, to genetically modify commensal bacterial populations at  mucosal surfaces ​in situ​. Bacteriophages present no human toxicity or pathogenicity, and are efficient  transduction vectors with high specificity.  However, to date, virtually all bacteriophage development focuses  on using ​lytic phages​ to kill specific pathogenic bacteria (i.e. bacteriophages as a new class of anti­microbial),  and little work has been done on engineering temperate ​ ​phages to modify the protein expression and secretion  profiles of commensal bacteria.  The primary research goal of this F32 training grant is to demonstrate the  proof of concept that engineered phages can mediate efficient transfer of genetic material to commensal  bacteria. In Aim 1, I will isolate three temperate bacteriophage from different S​ treptococcus Mitis​ strains,  introduce a reporter gene (Tag­RFP) into its genome, and assess their potency in transducing S​ . Mitis​ isolated  from human saliva via flow cytometry. Aim 2 extends this method to the display and secretion of model  therapeutic molecules. Using the most potent bacteriophage vector, I will incorporate model proteins linked to  bacterial secretion/display tags, and measure the extent that these proteins will be secreted by or displayed on  the same human derived ​S. mitis​.  In Aim 3, using gnotobiotic mice inoculated with human S​ . mitis​, I will  quantify the amount of secreted protein in the oral and gastrointestinal mucosa induced by engineered phage  particles, as well as antibody response to proteins presented on the surface of transduced ​S. mitis​. The results  will provide important insights into the potential use of temperate phages to modify commensal populations for  delivery of specific protein therapies and immunogens.