Molecular mechanisms of PKA mutations underlying Cushing's syndrome

项目摘要 长期高水平的应激激素皮质醇对许多器官系统有害。 促肾上腺皮质激素 独立性库欣综合征是一种内分泌紊乱，其中肾上腺组成性地产生 过量的皮质醇 症状包括肥胖、皮肤变薄、认知和情绪问题以及骨质疏松。 损失最近的研究已经确定了蛋白激酶A催化亚基（PKAc）的突变， 其中50%的案件。 这种突变L205 R位于PKAc的表面，与其调节亚基结合， 会破坏全酶的形成 传统上，环磷酸腺苷（cAMP）-β-D-蛋白激酶A（PKA）信号转导的模型依赖于 使用超生理水平的cAMP刺激的证据，这导致PKAc从 它的调节亚基和来自A-激酶锚定蛋白（AKAP）。最近的证据表明， cAMP水平不解离PKA全酶，从而重新定义细胞中PKA活化的模型。 基于这一新的信息，拟议的实验将测试PKAc中的库欣综合征突变是否 破坏活性PKA的定位并引起底物和下游皮质醇的异位磷酸化 分泌物该假设将在两个目标中进行检验： 目的1：PKAc L205 R的时空分布在库欣综合征中是否改变？综合战略 CRISPR/Cas9基因编辑和活细胞成像与光活化荧光团和FRET-基于 生物传感器将确定：1）突变的PKAc是否被募集到AKAP-1信号岛，2）这些库欣蛋白是否被激活， 突变体在细胞内更移动的，和3）如果PKAc活性异常地在亚细胞区域积累。 目的2：PKAc突变如何导致皮质醇过量产生？我会用化学生物学技术 结合NCI-295 R肾上腺细胞中的皮质醇测量1）以确定PKAc是否错误定位 活动是必要的，足以促进皮质醇的释放。接下来，通过将miniTurbo邻近标记与 磷酸化蛋白质组学，我将建立2）如果致病的L205 R PKAc突变体显示改变底物 选择性，不利地影响下游信号。 此外，肾上腺PKAc L205 R的小鼠模型 将产生表达以评估由此目的产生的候选治疗干预策略。 这项研究计划的长期目标是阐明潜在的信号转导的分子机制。 这将有助于研究疾病中的皮质醇增多症，并促进新治疗工具的开发。研究将在 在华盛顿大学的药理学系。这种环境提供了很好的训练 为学术-非学术博士后研究人员。 培训的好处包括内部和内部之间的强有力合作 部门，平易近人的主要研究人员进行创新工作，并经常研讨会，从 多个部门在各自领域拥有世界专家。

Project Summary    Chronically  high  levels  of  the  stress  hormone  cortisol  are  deleterious  to  many  organs  systems.  ACTH-­ independent  Cushing’s  syndrome  is  an  endocrine  disorder  wherein  the  adrenal  glands  constitutively  produce  excess  cortisol.  Symptoms  include  obesity,  thinning  of  the  skin,  cognitive  and  emotional  problems,  and  bone  loss. Recent studies have identified a mutation in the protein kinase A catalytic subunit (PKAc) in approximately  50%  of  these  cases.  This  mutation,  L205R,  is  on  the  face  of  PKAc  that  binds  to  its  regulatory  subunit,  and  is  predicted to disrupt holoenzyme formation.    Traditionally, the model for cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-­protein kinase A (PKA) signaling has relied  on evidence using supraphysiological levels of cAMP stimulation, which leads to full dissociation of PKAc from  its regulatory subunit and from A-­kinase anchoring proteins (AKAPs). Recent evidence shows that physiological  levels  of  cAMP  do  not  dissociate  PKA  holoenzymes,  thereby  redefining  the  model  of  PKA  activation  in  cells.  Based  on  this  new  information,  the  proposed  experiments  will  test  if  Cushing’s  syndrome  mutations  in  PKAc  disrupt  localization  of  active  PKA  and  cause  ectopic  phosphorylation  of  substrates  and  downstream  cortisol  secretion. The hypothesis will be tested in two aims:    Aim 1: Is the spatiotemporal profile of PKAc L205R altered in Cushing’s syndrome? A combined strategy  of  CRISPR/Cas9  gene-­editing  and  live-­cell  imaging  with  photoactivatable  fluorophores  and  FRET-­based  biosensors will ascertain: 1) if mutant PKAc is recruited to AKAP-­signaling islands, 2) whether these Cushing’s  mutants are more mobile inside cells, and 3) if PKAc activity aberrantly accumulates at subcellular regions.     Aim 2: How does mutant PKAc cause excess cortisol production? I will use chemical biology techniques  combined  with  cortisol  measurement  in  NCI-­H295R  adrenal  cells  1)  to  determine  if  mislocalization  of  PKAc  activity is necessary and sufficient to boost cortisol release. Next, by combining miniTurbo proximity labeling with  phospho-­proteomics,  I  will  establish  2)  if  the  disease-­causing  L205R  PKAc  mutant  displays  altered  substrate  selectivity  that  adversely  impacts  downstream  signaling.  Additionally,  a  mouse  model  of  adrenal  PKAc  L205R  expression will be generated to evaluate candidate therapeutic intervention strategies resulting from this aim.    The  long-­term  goals  of  this  research  plan  are  to  elucidate  molecular  mechanisms  of  the  signaling  underlying  hypercortisolism in disease and to spur development of new therapeutic tools. The research will be conducted  at the University of Washington in the Department of Pharmacology. This environment provides excellent training  for  academic-­track  postdoctoral  researchers.  Training  benefits  include  strong  collaboration  within  and  among  departments,  approachable  principal  investigators  performing  innovative  work,  and  frequent  seminars  from  multiple departments featuring world experts in their respective fields.