定向改造菌果聚糖合成酶提高催化产物聚合度专一性的研究

菌果聚糖合成酶可以催化蔗糖产生不同聚合度的菌果聚糖、低聚果糖和单糖。目前已经报道的菌果聚糖合成酶的活性和催化反应产物的专一性都较差，因此获得高活性和高催化产物专一性的酶具有重要的意义。由于目前还不清楚哪些氨基酸位点能影响该酶的活性和催化产物专一性，因此很难通过定点突变实现酶结构的定向改造。而本研究致力于采用分子定向进化方法结合酶的固定化来实现这一目的。本研究的成果包括：建立起了高效的土壤DNA提取和基因克隆新策略，成功实现了菌果聚糖合成酶基因的克隆；建立了高效的两步改组法，并以融合DNA克隆方式成功实现了菌果聚糖合成酶基因改组库的构建；首次利用蔗糖存在下的条件致死特性实现了对有活性的菌果聚糖合成酶的筛选和选择；采用薄层析法结合高效液相色谱成功筛选获得了活性和聚合度专一性均有提高的菌果聚糖合成酶；通过改组酶的固定化和通透性全细胞催化提高了酶的催化活性和热稳定性。同时，本研究所涉及的相关技术对同类研究也有重要的借鉴价值。