磷脂酰丝氨酸过量生物合成和代谢调控的研究

磷脂酰丝氨酸（PS）可以提高脑细胞活力，对治疗老年痴呆症和儿童多动症疗效明显，应用潜力巨大。目前PS生产方法效率极低，成为开发PS药物的瓶颈问题。本项目用磷脂酰丝氨酸合成酶连接丝氨酸代谢途径和磷脂代谢途径，经微生物直接发酵来制备PS，达到过量积累PS的效果。本项目根据代谢工程原理研究大肠杆菌磷脂代谢途径，对PS合成过程中关键酶进行调节，突变SerA以解除丝氨酸对其反馈抑制，通过重叠PCR技术对serA基因的第344和346位密码子进行定点突变，突变后密码子均为gcc，编码丙氨酸。将突变后的serA基因插入到表达载体pET28a(+)，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。诱导表达酶活力为出发菌株的5倍，活力达到711 U/mL并且不受L-丝氨酸的反馈抑制。但是经检测，高表达突变基因对菌株的L-丝氨酸产量也没有显著影响。敲除L-丝氨酸脱氨酶表达基因sdaA、sdaB和tdcG，菌株的产L-丝氨酸能力提高到了0.13 mmol/L，较出发菌株有较大提升。为进一步积累PS奠定了基础。继而敲除编码磷脂酰甘油磷酸酯酶的pgpA、pgpB基因，并测定各个突变株PS的含量变化，K-12（∆sdaA∆sdaB∆tdcG）中为1%、K-12（∆pgpA∆pg pB∆sdaA∆sdaB）中为1.5%、K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆tdcG）中为1.5%、K-12（∆pgpA∆ pgpB∆sdaB∆tdcG）中为1%，K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆sdaB∆tdcG）中为2.5%。加入羟胺抑制磷脂酰丝氨酸的降解后，菌株K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆sdaB∆tdcG）中磷脂酰丝氨酸的含量可进一步提高到12%左右。另外，随着磷脂酰丝氨酸的积累，菌体形态变长成丝状，而羟胺的加入则会使菌体的细胞璧内陷，菌体易裂解。.在菌株K-12（∆pgpA∆pgpB∆sdaA∆sdaB∆tdcG）的基础上，构建出重组表达质粒pSTV29-pssA-cdsA-serAdr，高效表达磷脂酰丝氨酸代谢途径中编码磷脂酰丝氨酸合成酶的pssA基因、CDP-二酰基甘油合成酶的cdsA基因、及定点突变后的3-磷酸甘油酸脱氢酶基因serAdr，再经羟胺处理，可获得磷脂酰丝氨酸进一步积累的工程菌株，最终可使磷脂酰丝氨酸的含量从0.5%提高到29%，开辟了微生物法直接合成PS的新途径。