In vivo phosphorylation dynamics of the Bordetella pertussis virulence-controlling response regulator BvgA.
In vivo phosphorylation dynamics of the Bordetella pertussis virulence-controlling response regulator BvgA.
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DOI：
10.1111/mmi.12177
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发表时间：
2013-04
影响因子：
3.6
通讯作者：
Stibitz S
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Boulanger A;Chen Q;Hinton DM;Stibitz S
我们已经使用通过用专有配体Phos-tag™衍生的聚丙烯酰胺凝胶的蛋白质电泳来将反应调节剂BvgA与其磷酸化的对应物BvgA~ P分离。这种方法使我们能够容易地确定BvgA在体外反应中或在不同实验室条件下生长的百日咳博德特氏菌的粗裂解物中的磷酸化程度。我们已经使用这种技术来检查B移位后BvgA磷酸化的动力学。百日咳培养物从非允许条件到允许条件的变化，或从允许条件到非允许条件的转变后其去磷酸化的变化。我们的研究结果提供了第一个直接的证据，BvgA~P在体内的水平在时间上对应于早期和晚期BvgA调控的毒力基因的表达。我们还研究了一些其他方面的BvgA功能预测从以前的研究和类推与其他两个组件响应调节器。这些包括BvgA磷酸化的位点，同源BvgS传感器激酶在其在百日咳博德特氏菌中的磷酸化中的独特作用，以及T194 M突变对磷酸化的影响。我们还检测到在大肠杆菌中表达后纯化的BvgA的一小部分但一致的磷酸化。
We have used protein electrophoresis through polyacrylamide gels derivatized with the proprietary ligand Phos-tag™ to separate the response regulator BvgA from its phosphorylated counterpart BvgA~P. This approach has allowed us to readily ascertain the degree of phosphorylation of BvgA in in vitro reactions, or in crude lysates of Bordetella pertussis grown under varying laboratory conditions. We have used this technique to examine the kinetics of BvgA phosphorylation after shift of B. pertussis cultures from non-permissive to permissive conditions, or of its dephosphorylation following a shift from permissive to non-permissive conditions. Our results provide the first direct evidence that levels of BvgA~P in vivo correspond temporally to the expression of early and late BvgA-regulated virulence genes. We have also examined a number of other aspects of BvgA function predicted from previous studies and by analogy with other two component response regulators. These include the site of BvgA phosphorylation, the exclusive role of the cognate BvgS sensor kinase in its phosphorylation in Bordetella pertussis, and the effect of the T194M mutation on phosphorylation. We also detected the phosphorylation of a small but consistent fraction of BvgA purified after expression in Escherichia coli.
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