Kinetics of dCas9 target search in Escherichia coli.
Kinetics of dCas9 target search in Escherichia coli.
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DOI：
10.1126/science.aah7084
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发表时间：
2017-09-29
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Elf J
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Jones DL;Leroy P;Unoson C;Fange D;Ćurić V;Lawson MJ;Elf J
一个细胞能以多快的速度定位由单链寡核苷酸指定的特定染色体DNA序列？为了解决这个问题，我们研究了CRISPR相关蛋白Cas9的细胞内搜索过程，该蛋白可以通过指导RNA编程以基本上结合任何DNA序列。这种靶向灵活性需要Cas9解开DNA双螺旋以测试与指导RNA的正确碱基配对。在这里，我们通过结合单分子荧光显微镜和批量限制性保护测定来研究活大肠杆菌中催化失活的dCas9的搜索机制。我们发现，单个荧光标记的dCas9需要6小时才能找到正确的靶序列，这意味着每个潜在的靶点结合不到30 ms。为了实现快速靶向，Cas9及其指导RNA必须以高浓度存在。
How fast can a cell locate a specific chromosomal DNA sequence specified by a single stranded oligonucleotide? To address this question we investigate the intracellular search processes of the CRISPR-associated protein Cas9, which can be programmed by a guide RNA to bind essentially any DNA sequence. This targeting flexibility requires Cas9 to unwind the DNA double helix to test for correct base pairing to the guide RNA. Here we study the search mechanisms of the catalytically inactive dCas9 in living Escherichia coli by combining single molecule fluorescence microscopy and bulk restriction protection assays. We find that it takes a single fluorescently labeled dCas9 six hours to find the correct target sequence, which implies that each potential target is bound for less than 30 ms. Once bound, dCas9 remains associated until replication. To achieve fast targeting, both Cas9 and its guide RNA have to be present at high concentrations.
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DOI：
10.1073/pnas.56.6.1891
发表时间：
1966-01-01
影响因子：
11.1
作者：
GILBERT, W;MULLERHI.B
通讯作者：
MULLERHI.B
DOI：
10.1083/jcb.201604115
发表时间：
2016-08-29
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Ma H;Tu LC;Naseri A;Huisman M;Zhang S;Grunwald D;Pederson T
通讯作者：
Pederson T
影响因子：
30.8
作者：
Hammar P;Walldén M;Fange D;Persson F;Baltekin O;Ullman G;Leroy P;Elf J
通讯作者：
Elf J
影响因子：
56.9
作者：
Knight, Spencer C.;Xie, Liangqi;Tjian, Robert
通讯作者：
Tjian, Robert
影响因子：
56.9
作者：
Jinek, Martin;Chylinski, Krzysztof;Charpentier, Emmanuelle
通讯作者：
Charpentier, Emmanuelle