Adenylation enzyme characterization using gamma -(18)O(4)-ATP pyrophosphate exchange.
Adenylation enzyme characterization using gamma -(18)O(4)-ATP pyrophosphate exchange.
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DOI：
10.1016/j.chembiol.2009.04.007
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发表时间：
2009-05-29
影响因子：
--
通讯作者：
Bachmann BO
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Phelan VV;Du Y;McLean JA;Bachmann BO
我们在这里提出了一种快速，高灵敏度的非放射性测定腺苷酸化酶的选择性测定和表征。该方法通过MALDI-TOFMS、ESI-LC/MS或ESI-LC/MS/MS测量未标记的焦磷酸盐向γ-18O4标记的ATP的同位素反交换，并对已知特异性的非核糖体合成酶（TycA、ValA）和核糖体合成酶（TrpRS、LysRS）进行了证明。这种低体积（6μL）方法检测到低至0.01%（600 fmol）的交换，灵敏度与先前报道的放射性测定相当，并易于适用于广谱合成酶的动力学测量和高通量分析。最后，在嗜热菌S中发现了一个以前未表征的来自炭疽霉素生物合成的A-T双结构域。refreinius在47 °C下选择性激活4-甲基-3-羟基邻氨基苯甲酸，为一个新的芳香族β-氨基酸激活腺苷酸化结构域和首次对氨霉素生物合成基因簇的功能分析提供了生化证据。
We present here a rapid, highly sensitive nonradioactive assay for adenylation enzyme selectivity determination and characterization. This method measures the isotopic back exchange of unlabeled pyrophosphate into γ–18O4-labeled ATP via MALDI-TOFMS, ESI-LC/MS or ESI-LC/MS/MS and is demonstrated for both nonribosomal (TycA, ValA) and ribosomal synthetases (TrpRS, LysRS) of known specificity. This low volume (6μL) method detects as little as 0.01% (600 fmol) exchange, comparable in sensitivity to previously reported radioactive assays and readily adaptable to kinetics measurements and high throughput analysis of a wide spectrum of synthetases. Finally, a previously uncharacterized A-T didomain from anthramycin biosynthesis in the thermophile S. refuinius was demonstrated to selectively activate 4-methyl-3-hydroxyanthranilic acid at 47 °C, providing biochemical evidence for a new aromatic β–amino acid activating adenylation domain and the first functional analysis of the anthramycin biosynthetic gene cluster.
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