Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly.
Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly.
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DOI：
10.1093/nar/gkt062
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发表时间：
2013-04-01
影响因子：
14.9
通讯作者：
Zhao R
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Li X;Zhang W;Xu T;Ramsey J;Zhang L;Hill R;Hansen KC;Hesselberth JR;Zhao R
Prp 8在数百种剪接因子中脱颖而出，是一种密切参与剪接体激活和催化反应的蛋白质。在这里，我们提出了第一个全面的体内RNA足迹Prp 8在芽殖酵母获得使用CLIP（交联和免疫沉淀）/CRAC（交联和cDNA分析）和下一代DNA测序。这些足迹包括已知的直接Prp 8结合位点的U 5，U6 snRNA和含内含子的前体mRNA使用定点交联与体外组装的小核核糖核蛋白（snRNP）或剪接体。此外，我们的研究结果揭示了U1和U2 snRNA上新的Prp 8结合位点。我们证明Prp 8直接与纯化的活化剪接体中的U2、U 5和U6 snRNA和前mRNA交联，将Prp 8置于适当位置以将活性位点的组分聚集在一起。此外，Prp 8和U1 snRNA相互作用的破坏降低了剪接体中的三-snRNP水平，表明Prp 8通过其与U1 snRNA的相互作用在剪接体组装中的先前未知的作用。
Prp8 stands out among hundreds of splicing factors as a protein that is intimately involved in spliceosomal activation and the catalytic reaction. Here, we present the first comprehensive in vivo RNA footprints for Prp8 in budding yeast obtained using CLIP (cross-linking and immunoprecipitation)/CRAC (cross-linking and analyses of cDNAs) and next-generation DNA sequencing. These footprints encompass known direct Prp8-binding sites on U5, U6 snRNA and intron-containing pre-mRNAs identified using site-directed cross-linking with in vitro assembled small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) or spliceosome. Furthermore, our results revealed novel Prp8-binding sites on U1 and U2 snRNAs. We demonstrate that Prp8 directly cross-links with U2, U5 and U6 snRNAs and pre-mRNA in purified activated spliceosomes, placing Prp8 in position to bring the components of the active site together. In addition, disruption of the Prp8 and U1 snRNA interaction reduces tri-snRNP level in the spliceosome, suggesting a previously unknown role of Prp8 in spliceosomal assembly through its interaction with U1 snRNA.
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