Comprehensive optimization of a reporter assay toolbox for three distinct CRISPR-Cas systems.
Comprehensive optimization of a reporter assay toolbox for three distinct CRISPR-Cas systems.
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针对三种不同 CRISPR-Cas 系统的报告分析工具箱的全面优化
DOI：
10.1002/2211-5463.13198
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发表时间：
2021-07
期刊：
影响因子：
2.6
通讯作者：
Wang Y
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Chen L;Gao H;Zhou B;Wang Y
聚集的、有规则间隔的、短回文重复序列相关的DNA核酸酶（CRISPR - Cas）蛋白质系统允许通过诱导双链断裂进行可编程的基因编辑。DNA切割和DNA修复事件的报告分析在推进CRISPR技术和提高我们对潜在分子机制的理解方面发挥着重要作用。在这里，我们开发了一系列报告基因分析来探索各种编辑过程的作用机制，包括非同源DNA末端连接、同源定向修复和单链退火。通过特殊的靶标设计，作为优化工具箱的报告基因检测可用于利用三种不同的CRISPR - Cas系统（化脓性链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9和新葡萄球菌U112 Cpf1）和两种不同的报告基因（GFP和Gaussia荧光素酶）。我们使用一系列小分子（包括NU7441、RI‐1和Mirin）进一步验证了Gaussia报告基因试验，并展示了GFP报告基因试验作为富集编辑基因组细胞的有效工具的使用。我们引入了一系列优化的集群化、有规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）报告基因检测，这些检测可以使用三种CRISPR - Cas系统，化脓性链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9和新菌株Francisella U112 Cpf1，用于探测各种基因编辑机制，包括非同源DNA末端连接、同源定向修复和单链退火。使用GFP和Gaussia荧光素酶作为报告器支持各种应用，包括高通量药物筛选和编辑细胞群的富集。
The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats‐associated DNA nuclease (CRISPR‐Cas) protein system allows programmable gene editing through inducing double‐strand breaks. Reporter assays for DNA cleavage and DNA repair events play an important role in advancing the CRISPR technology and improving our understanding of the underlying molecular mechanisms. Here, we developed a series of reporter assays to probe mechanisms of action of various editing processes, including nonhomologous DNA end joining, homology‐directed repair and single‐strand annealing. With special target design, the reporter assays as an optimized toolbox can be used to take advantage of three distinct CRISPR‐Cas systems (Streptococcus pyogenes Cas9, Staphylococcus aureus Cas9 and Francisella novicida U112 Cpf1) and two different reporters (GFP and Gaussia luciferase). We further validated the Gaussia reporter assays using a series of small molecules, including NU7441, RI‐1 and Mirin, and showcased the use of a GFP reporter assay as an effective tool for enrichment of cells with edited genome. We introduce a series of optimized clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR) reporter assays that can use three CRISPR‐Cas systems, Streptococcus pyogenes Cas9, Staphylococcus aureus Cas9 and Francisella novicida U112 Cpf1, for probing various gene‐editing mechanisms, including nonhomologous DNA end joining, homology‐directed repair and single‐strand annealing. The use of GFP and Gaussia luciferase as reporters supports various applications, including high‐throughput drug screening and enrichment of the edited cell population.
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