High-throughput detection of induced mutations and natural variation using KeyPoint technology.
High-throughput detection of induced mutations and natural variation using KeyPoint technology.
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DOI：
10.1371/journal.pone.0004761
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发表时间：
2009
期刊：
影响因子：
3.7
通讯作者：
van Eijk MJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Rigola D;van Oeveren J;Janssen A;Bonné A;Schneiders H;van der Poel HJ;van Orsouw NJ;Hogers RC;de Both MT;van Eijk MJ
反向遗传学方法依赖于检测目标基因中的序列改变，以在突变体或自然群体中鉴定等位基因变体。当前的（预）筛选方法，如定向诱导基因组局部突变技术（TILLING）和生态定向诱导基因组局部突变技术（EcoTILLING），是基于使用内切核酸酶（如CEL 1）检测异源双链中的单碱基错配。然而，由于内切核酸酶相对较差的切割效率和核酸外切酶活性，其使用存在缺陷。此外，预筛选方法无法揭示序列变化的性质及其对基因功能可能产生的影响。我们介绍关键位点（KeyPoint™）技术，这是一种基于对从突变体或自然群体中扩增的目标基因进行大规模平行测序的高通量突变/多态性发现技术。关键位点技术将大量单个DNA样本的多维混合以及样本识别标签（“样本条形码”）的使用与新一代测序技术相结合。我们通过在一次GS FLX测序运行中筛选3000多个M2家系鉴定出番茄真核起始因子4E（eIF4E）基因的两个突变体，并通过对来自欧盟 - 太阳（EU - SOL）核心种质库的92个番茄品系的一个子集的三个扩增子进行重测序发现番茄eIF4E基因的六种单倍型，从而展示了关键位点技术的强大功能。我们提出关键位点技术可作为一种广泛适用的扩增子测序方法，以高通量的方式筛选突变群体或种质资源库，用于鉴定（新的）等位基因变异。
Reverse genetics approaches rely on the detection of sequence alterations in target genes to identify allelic variants among mutant or natural populations. Current (pre-) screening methods such as TILLING and EcoTILLING are based on the detection of single base mismatches in heteroduplexes using endonucleases such as CEL 1. However, there are drawbacks in the use of endonucleases due to their relatively poor cleavage efficiency and exonuclease activity. Moreover, pre-screening methods do not reveal information about the nature of sequence changes and their possible impact on gene function. We present KeyPoint™ technology, a high-throughput mutation/polymorphism discovery technique based on massive parallel sequencing of target genes amplified from mutant or natural populations. KeyPoint combines multi-dimensional pooling of large numbers of individual DNA samples and the use of sample identification tags (“sample barcoding”) with next-generation sequencing technology. We show the power of KeyPoint by identifying two mutants in the tomato eIF4E gene based on screening more than 3000 M2 families in a single GS FLX sequencing run, and discovery of six haplotypes of tomato eIF4E gene by re-sequencing three amplicons in a subset of 92 tomato lines from the EU-SOL core collection. We propose KeyPoint technology as a broadly applicable amplicon sequencing approach to screen mutant populations or germplasm collections for identification of (novel) allelic variation in a high-throughput fashion.
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