Bacterial lipopolysaccharide copurifies with plasmid DNA: implications for animal models and human gene therapy.
Bacterial lipopolysaccharide copurifies with plasmid DNA: implications for animal models and human gene therapy.
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细菌脂多糖与质粒 DNA 共纯化：对动物模型和人类基因治疗的影响。
DOI：
10.1089/hum.1995.6.3-317
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发表时间：
1995
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Carson,DA
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Wicks,IP;Howell,ML;Hancock,T;Kohsaka,H;Olee,T;Carson,DA
在啮齿动物基因治疗实验过程中，使用肌肉注射源自大肠杆菌的质粒 DNA，我们注意到剂量相关的毒性。这一观察结果促使人们寻找 DNA 样本中可能存在的污染物。我们使用高度特异性和灵敏的鲎变形细胞裂解物测定（LAL）来监测DNA样品中的内毒素生物活性，并发现源自标准大肠杆菌的质粒DNA。使用传统的 DNA 分离方案，可以检测到被内毒素或脂多糖 (LPA) 严重污染的大肠杆菌菌株。标准 DNA 分离程序可共纯化高达 500 μg/ml 的 LPS。 LPS 是细胞因子和其他炎症介质的有效诱导剂，可能会使基因治疗中裸露 DNA 的使用变得复杂。内毒素与质粒 DNA 的共纯化对于体外转染研究和 DNA 显微注射到胚胎中也具有重要意义。开发了一种简单有效的方案来减少质粒 DNA 的 LPS 污染。在分离质粒 DNA 之前将完整细菌转化为原生质球，与溶菌酶一起孵育，用去污剂正辛基-β-d-吡喃硫代葡萄糖苷 (OSPG) 处理和多粘菌素-B (PMB) 层析，允许分离含有低于 50 ng/ml LPS 的质粒 DNA。与传统的质粒 DNA 纯化方法相比，这意味着 LPS 污染减少了 10,000 倍，避免了潜在有毒的试剂（如溴化乙锭），并产生了更高的质粒 DNA 产量。
During the course of gene therapy experiments in rodents, using intramuscular injections of plasmid DNA derived fromEscherichia coli, we noted dose-related toxicity. This observation prompted a search for possible contaminants of DNA samples. We used the highly specific and sensitive limulus amoebocyte lysate assay (LAL), to monitor endotoxin bioactivity in DNA samples, and found plasmid DNA derived from standardE. colibacterial strains, using traditional DNA isolation protocols, to be heavily contaminated with endotoxin, or lipopolysaccharide (LPA). Standard DNA isolation procedures result in the copurification of up to 500 μg/ml of LPS. LPS is a potent inducer of cytokines and other inflammatory mediators, and may complicate the use of naked DNA in gene therapy. The copurification of endotoxin with plasmid DNA also has important implications forin vitrotransfection studies and microinjection of DNA into embryos. A simple and efficient protocol to reduce LPS contamination of plasmid DNA was developed. The conversion of intact bacteria to spheroplasts prior to the isolation of plasmid DNA, incubation with lysozyme, treatment with the detergentn-octyl-β-d-thioglucopyranoside (OSPG) and polymyxin-B (PMB) chromatography, allowed the isolation of plasmid DNA containing less than 50 ng/ml LPS. This represents a 10,000-fold reduction in LPS contamination, compared to conventional methods of plasmid DNA purification, avoids potentially toxic reagents such as ethidium bromide, and produces a higher yield of plasmid DNA.
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