Gelatin degradation assay reveals MMP-9 inhibitors and function of O-glycosylated domain.
Gelatin degradation assay reveals MMP-9 inhibitors and function of O-glycosylated domain.
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明胶降解测定揭示了 MMP-9 抑制剂和 O-糖基化结构域的功能。
DOI：
--
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发表时间：
2011
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
G. Opdenakker
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
J. Vandooren;N. Geurts;E. Martens;P. E. Van den Steen;S. D. Jonghe;P. Herdewijn;G. Opdenakker
目的
建立一种新的、灵敏的、高通量的明胶酶分析方法，以确定新的抑制剂并比较明胶酶B/基质金属蛋白酶（MMP）-9的结构域缺失突变体。
方法
使用荧光染料淬灭（DQ）™-明胶作为底物，并优化生化参数（底物和酶浓度、DMSO溶剂浓度）以建立高通量测定系统。对杂环类药物物质的各种小型文库（ChemDiv、InterBioScreen和ChemBridge）进行了测试，并与原型抑制剂进行了比较。
结果
首先，我们设计了一个测试系统，明胶作为一种天然基质。其次，通过选择新型嘧啶-2，4，6-三酮（巴比妥酸盐）抑制剂验证了该测定法。第三，与目前关于胶原溶解的结构数据一致，发现O-糖基化区域的缺失显著降低明胶溶解活性（k（cat）/k（M）比全长MMP-9低± 40%）。
结论
DQ™-明胶测定可用于高通量药物筛选和外位点靶向。我们证明了催化和血红素结合蛋白结构域之间的灵活性是明胶溶解的功能关键。
AIM
To establish a novel, sensitive and high-throughput gelatinolytic assay to define new inhibitors and compare domain deletion mutants of gelatinase B/matrix metalloproteinase (MMP)-9.
METHODS
Fluorogenic Dye-quenched (DQ)™-gelatin was used as a substrate and biochemical parameters (substrate and enzyme concentrations, DMSO solvent concentrations) were optimized to establish a high-throughput assay system. Various small-sized libraries (ChemDiv, InterBioScreen and ChemBridge) of heterocyclic, drug-like substances were tested and compared with prototypic inhibitors.
RESULTS
First, we designed a test system with gelatin as a natural substrate. Second, the assay was validated by selecting a novel pyrimidine-2,4,6-trione (barbiturate) inhibitor. Third, and in line with present structural data on collagenolysis, it was found that deletion of the O-glycosylated region significantly decreased gelatinolytic activity (k(cat)/k(M) ± 40% less than full-length MMP-9).
CONCLUSION
The DQ™-gelatin assay is useful in high-throughput drug screening and exosite targeting. We demonstrate that flexibility between the catalytic and hemopexin domain is functionally critical for gelatinolysis.
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Schlegel HB
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10.1016/j.matbio.2004.05.002
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--
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Xiaoping Xu;Yao Wang;Janelle L. Lauer-Fields;G. Fields;B. Steffensen
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