A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.
A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing.
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CRISPR-CAS9编辑验证策略的调查。
DOI：
10.1038/s41598-018-19441-8
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发表时间：
2018-01-17
影响因子：
4.6
通讯作者：
Pruett-Miller SM
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Sentmanat MF;Peters ST;Florian CP;Connelly JP;Pruett-Miller SM
T7核酸内切酶I（T7 E1）错配检测测定是用于评估位点特异性核酸酶（例如成簇规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas9系统）的活性的广泛使用的方法。为了确定该测定法的准确性和灵敏度，我们将T7 E1测定法得出的编辑估计值与经编辑的哺乳动物细胞池中的靶向下一代测序（NGS）的编辑估计值进行了比较。在这里，我们报告说，由T7 E1确定的核酸酶活性的估计值通常不能准确反映编辑细胞中观察到的活性。通过T7 E1具有相似活性的CRISPR-Cas9复合物的编辑效率可以通过NGS证明显著不同。此外，我们将通过分解追踪插入缺失（TIDE）测定和扩增子分析插入缺失检测（IDAA）测定预测的编辑效率与通过靶向NGS观察到的细胞池和单细胞衍生克隆的编辑效率进行了比较。我们表明，靶向NGS，TIDE和IDAA测定预测细胞池的编辑效率相似，但TIDE和IDAA可能会错误调用编辑克隆中的等位基因。
The T7 endonuclease 1 (T7E1) mismatch detection assay is a widely used method for evaluating the activity of site-specific nucleases, such as the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 system. To determine the accuracy and sensitivity of this assay, we compared the editing estimates derived by the T7E1 assay with that of targeted next-generation sequencing (NGS) in pools of edited mammalian cells. Here, we report that estimates of nuclease activity determined by T7E1 most often do not accurately reflect the activity observed in edited cells. Editing efficiencies of CRISPR-Cas9 complexes with similar activity by T7E1 can prove dramatically different by NGS. Additionally, we compared editing efficiencies predicted by the Tracking of Indels by Decomposition (TIDE) assay and the Indel Detection by Amplicon Analysis (IDAA) assay to that observed by targeted NGS for both cellular pools and single-cell derived clones. We show that targeted NGS, TIDE, and IDAA assays predict similar editing efficiencies for pools of cells but that TIDE and IDAA can miscall alleles in edited clones.
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影响因子：
46.9
作者：
Doench JG;Fusi N;Sullender M;Hegde M;Vaimberg EW;Donovan KF;Smith I;Tothova Z;Wilen C;Orchard R;Virgin HW;Listgarten J;Root DE
通讯作者：
Root DE
影响因子：
64.8
作者：
Anders, Carolin;Niewoehner, Ole;Duerst, Alessia;Jinek, Martin
通讯作者：
Jinek, Martin
影响因子：
46.9
作者：
Cho, Seung Woo;Kim, Sojung;Kim, Jin-Soo
通讯作者：
Kim, Jin-Soo
影响因子：
7.7
作者：
Horlbeck, Max A.;Witkowsky, Lea B.;Weissman, Jonathan S.
通讯作者：
Weissman, Jonathan S.
影响因子：
3.5
作者：
Liesche C;Venkatraman L;Aschenbrenner S;Grosse S;Grimm D;Eils R;Beaudouin J
通讯作者：
Beaudouin J