Recombinase Polymerase Amplification Assay with and without Nuclease-Dependent-Labeled Oligonucleotide Probe.
Recombinase Polymerase Amplification Assay with and without Nuclease-Dependent-Labeled Oligonucleotide Probe.
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DOI：
10.3390/ijms222111885
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发表时间：
2021-11-02
影响因子：
5.6
通讯作者：
Dzantiev BB
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ivanov AV;Safenkova IV;Zherdev AV;Dzantiev BB
重组酶聚合酶扩增（RPA）和侧流试验（LFT）的组合是在资源有限的条件下快速检测病原体的强大诊断工具。在这里，我们比较了两种在LFT检测后生成标记RPA扩增子的方法：（1）基本方法，其中引物在末端修饰有不同的标签;（2）核酸酶依赖性方法，其中引物和标记寡核苷酸探针用于核酸酶消化，推荐用于检测的高特异性。利用这两种方法，我们开发了RPA-LFT检测世界范围内分布的植物病原体苜蓿花叶病毒（AMV）。设计了一条荧光素修饰的正向引物和一条生物素标记的反向引物，并用荧光素标记的寡核苷酸探针进行RPA验证。这两种标记方法及其相关的检测，其特征在于使用体外转录的AMV的mRNA和逆转录反应。结果表明，基于引物标记的RPA-LFT测定在30 min内检测到103个RNA拷贝，并且具有比探针依赖的RPA-LFT低22倍的半最大结合浓度。建立的RPA-LFT方法已成功应用于AMV感染植物的检测。这一结果可能是选择简单的引物标记RPA-LFT检测其他病原体的主要原因。
The combination of recombinase polymerase amplification (RPA) and lateral flow test (LFT) is a strong diagnostic tool for rapid pathogen detection in resource-limited conditions. Here, we compared two methods generating labeled RPA amplicons following their detection by LFT: (1) the basic one with primers modified with different tags at the terminals and (2) the nuclease-dependent one with the primers and labeled oligonucleotide probe for nuclease digestion that was recommended for the high specificity of the assay. Using both methods, we developed an RPA-LFT assay for the detection of worldwide distributed phytopathogen—alfalfa mosaic virus (AMV). A forward primer modified with fluorescein and a reverse primer with biotin and fluorescein-labeled oligonucleotide probe were designed and verified by RPA. Both labeling approaches and their related assays were characterized using the in vitro-transcribed mRNA of AMV and reverse transcription reaction. The results demonstrated that the RPA-LFT assay based on primers-labeling detected 103 copies of RNA in reaction during 30 min and had a half-maximal binding concentration 22 times lower than probe-dependent RPA-LFT. The developed RPA-LFT was successfully applied for the detection of AMV-infected plants. The results can be the main reason for choosing simple labeling with primers for RPA-LFT for the detection of other pathogens.
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