A novel photoactivatable cross-linker for the functionally-directed region-specific fluorescent labeling of proteins.
A novel photoactivatable cross-linker for the functionally-directed region-specific fluorescent labeling of proteins.
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一种新型光活化交联剂，用于蛋白质功能定向区域特异性荧光标记。
DOI：
10.1111/j.1432-1033.1992.tb16949.x
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发表时间：
1992
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Shohet,SB
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Thevenin,BJ;Shahrokh,Z;Williard,RL;Fujimoto,EK;Kang,JJ;Ikemoto,N;Shohet,SB
合成了一种可切割的交联剂sulfosuccinimidyl‐2(7‐azido‐4‐methycoumarin‐3‐acetamido)‐ethyl‐1，3′‐dithiopropionate(SAED)，用于将香豆素荧光团从供体蛋白选择性转移到相互作用的靶蛋白结合部位附近的位置。SAED含有用于与供体偶联的末端N-磺基琥珀酰亚胺酯，用于与相互作用的靶分子交联的末端可光激活的叠氮香豆素物种，以及用于在切割后释放标记的靶分子的中心二离基间隔体。为了评价该标记试剂的有效性，将大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)用SAED衍生化，然后在胰酶存在下进行光解。通过SDS/PAGE观察到单一的荧光交联物种(占总STI的6-7mol%)，经反射切割后显示为1：1的STI-胰酶复合体。在没有光解或失活交联剂的情况下，不能检测到该复合体。重要的是，复合体的形成被过量的未经修饰的STI抑制，并通过用非相互作用的蛋白质替代胰酶来防止。对交联复合体的切割表明，胰酶是荧光的，但不是STI；未复合的胰酶部分仍未标记。这些结果证明了SAED荧光转移交联法标记胰酶的特异性。计算出这种交联剂介导的胰酶标记的效率约为15%。SAED的短交联跨度(≤1.8 nm)将标记严格限制在胰酶与STI的接触区附近。因此，这种新型交联剂允许在功能上重要的结合位点附近对荧光团进行区域特异性靶向。
A cleavable cross‐linking reagent, sulfosuccinimidyl‐2(7‐azido‐4‐methycoumarin‐3‐acetamido)‐ethyl‐1,3′‐dithiopropionate (SAED), was synthesized for the selective transfer of a coumarin fluorophore from a ‘donor’ protein to a position near the binding site of an interacting ‘target’ protein. SAED contains a terminalN‐sulfoscuccinimidyl ester for conjugation to the donor, a terminal photoactivatable azido‐coumarin species for cross‐linking with the interacting target, and a central disculfide spacer for the release of the labeled target after cleavage. To evaluate the effectiveness of this labeling reagent, soynean trypsin inhibitor (STI) was derivatized (∼ 0.5 mol/mol) with SAED and then photolyzed in the presence of trypsin. A single fluorescent cross–linked species (6–7 mol% of total STI) was observed by SDS/PAGE and, after refuctive cleavage, was shown to be a 1: 1 STI‐trypsin complex. This complex was not detected without photolysis or with an inactivated cross‐linker. Importantly, complex formation was inhibited by an excess of unmodified STI and prevented by substitution of a non‐interacting protein for trypsin. Cleavage of the cross‐linked complex revealed that the trypsin, but not the STI, was fluorescent; the uncomplexed trypsin fraction remained unlabeled. These results demonstrated the specificty of the labeling of trypsin by fluorescent‐transfer cross‐linking with SAED. An efficiency of about 15% for this cross‐linking mediated labeling of trypsin was calculated. The short cross‐linking span of SAED (≤1.8nm) strictly limited the labeling to the vicinity of the contact region of trypsin with STI. thus, this novel cross‐linker permits the region‐specific targeting of a fluorophore near a functionally important binding site.
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--
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--
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通讯作者：
T. Ji
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T. Ji
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--
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F. Richards