Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs.
Cas9-assisted recombineering in C. elegans: genome editing using in vivo assembly of linear DNAs.
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DOI：
10.1093/nar/gkw502
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发表时间：
2016-09-06
影响因子：
14.9
通讯作者：
Seydoux G
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Paix A;Schmidt H;Seydoux G
生物工程，使用内源同源重组系统在体内重组DNA，是微生物中基因组编辑的常用技术。目前还没有针对动物的修复技术，在动物中，基于非同源性的机制被认为主导DNA修复。在这里，我们证明，使用秀丽隐杆线虫，线性DNA与短同源性（约35个碱基）从事一个高效的基因转换机制。与双链断裂（DSB）的仅一侧同源的线性DNA修复模板有效地启动修复，并且模板之间的短重叠支持模板转换。我们展示了使用单链桥接寡核苷酸（ssODN）靶向PCR片段以修复染色体上由CRISPR/Cas9诱导的DSB。基于这些发现，我们开发了用于精确基因组编辑的重组工程策略，该策略扩展了ssODNs的实用性并消除了用于模板构建的体外克隆步骤。我们将这些方法应用于产生GFP敲入等位基因和没有共整合标记的基因替换。我们的结论是，像微生物一样，后生动物具有强大的同源依赖性修复机制，可以用于重组工程和基因组编辑。
Recombineering, the use of endogenous homologous recombination systems to recombine DNA in vivo, is a commonly used technique for genome editing in microbes. Recombineering has not yet been developed for animals, where non-homology-based mechanisms have been thought to dominate DNA repair. Here, we demonstrate, using Caenorhabditis elegans, that linear DNAs with short homologies (∼35 bases) engage in a highly efficient gene conversion mechanism. Linear DNA repair templates with homology to only one side of a double-strand break (DSB) initiate repair efficiently, and short overlaps between templates support template switching. We demonstrate the use of single-stranded, bridging oligonucleotides (ssODNs) to target PCR fragments for repair of DSBs induced by CRISPR/Cas9 on chromosomes. Based on these findings, we develop recombineering strategies for precise genome editing that expand the utility of ssODNs and eliminate in vitro cloning steps for template construction. We apply these methods to the generation of GFP knock-in alleles and gene replacements without co-integrated markers. We conclude that, like microbes, metazoans possess robust homology-dependent repair mechanisms that can be harnessed for recombineering and genome editing.
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影响因子：
7.2
作者：
Morrical, Scott W.
通讯作者：
Morrical, Scott W.
DOI：
10.1126/science.1191125
发表时间：
2010-07-02
期刊：
Science (New York, N.Y.)
影响因子：
--
作者：
Hicks WM;Kim M;Haber JE
通讯作者：
Haber JE
影响因子：
56.9
作者：
Lowden, Mia Rochelle;Flibotte, Stephane;Ahmed, Shawn
通讯作者：
Ahmed, Shawn
影响因子：
1.2
作者：
Carreira-Rosario, Arnaldo;Scoggin, Shane;Buszczak, Michael
通讯作者：
Buszczak, Michael
影响因子：
5.3
作者：
Storici, Francesca;Snipe, Joyce R.;Resnick, Michael A.
通讯作者：
Resnick, Michael A.