High fidelity CRISPR/Cas9 increases precise monoallelic and biallelic editing events in primordial germ cells.
High fidelity CRISPR/Cas9 increases precise monoallelic and biallelic editing events in primordial germ cells.
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DOI：
10.1038/s41598-018-33244-x
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发表时间：
2018-10-11
影响因子：
4.6
通讯作者：
McGrew MJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Idoko-Akoh A;Taylor L;Sang HM;McGrew MJ
原始生殖细胞（PGCs）是精子和卵子的胚胎前体，用于将遗传修饰引入鸟类基因组。使用基因组编辑引入小的定义序列尚未在鸟类物种中得到证实。在这里，我们比较了在PGC中使用野生型SpCas 9（SpCas 9-WT）和高保真SpCas 9-HF 1的利福昔肽介导的HDR，并表明鸡PGC中的许多基因座可以使用含有位于前间隔区邻近基序（PAM）中的CRISPR/Cas9阻断突变的供体进行精确编辑。然而，当仅将突变引入gRNA靶序列时，使用SpCas 9-HF 1靶向更有效。我们随后采用eGFP至BFP转化测定，以直接比较由SpCas 9-WT和SpCas 9-HF 1介导的HDR，并发现SpCas 9-HF 1增加HDR同时减少INDEL形成。此外，与SpCas 9-WT相比，SpCas 9-HF 1增加了单等位基因编辑的频率。我们使用SpCas 9-HF 1来证明将单等位基因和双等位基因点突变引入FGF 20基因中，并产生具有确定的纯合和杂合基因型的编辑的PGC的克隆群体。我们的结果证明了使用寡核苷酸供体和高保真CRISPR/Cas9变体在PGC中高效地进行精确的基因组编辑。
Primordial germ cells (PGCs), the embryonic precursors of the sperm and egg, are used for the introduction of genetic modifications into avian genome. Introduction of small defined sequences using genome editing has not been demonstrated in bird species. Here, we compared oligonucleotide-mediated HDR using wild type SpCas9 (SpCas9-WT) and high fidelity SpCas9-HF1 in PGCs and show that many loci in chicken PGCs can be precise edited using donors containing CRISPR/Cas9-blocking mutations positioned in the protospacer adjacent motif (PAM). However, targeting was more efficient using SpCas9-HF1 when mutations were introduced only into the gRNA target sequence. We subsequently employed an eGFP-to-BFP conversion assay, to directly compare HDR mediated by SpCas9-WT and SpCas9-HF1 and discovered that SpCas9-HF1 increases HDR while reducing INDEL formation. Furthermore, SpCas9-HF1 increases the frequency of single allele editing in comparison to SpCas9-WT. We used SpCas9-HF1 to demonstrate the introduction of monoallelic and biallelic point mutations into the FGF20 gene and generate clonal populations of edited PGCs with defined homozygous and heterozygous genotypes. Our results demonstrate the use of oligonucleotide donors and high fidelity CRISPR/Cas9 variants to perform precise genome editing with high efficiency in PGCs.
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影响因子：
4.6
作者：
Inui M;Miyado M;Igarashi M;Tamano M;Kubo A;Yamashita S;Asahara H;Fukami M;Takada S
通讯作者：
Takada S
影响因子：
3.7
作者：
Dimitrov L;Pedersen D;Ching KH;Yi H;Collarini EJ;Izquierdo S;van de Lavoir MC;Leighton PA
通讯作者：
Leighton PA
影响因子：
7
作者：
Cho SW;Kim S;Kim Y;Kweon J;Kim HS;Bae S;Kim JS
通讯作者：
Kim JS
影响因子：
17.3
作者：
Gaj, Thomas;Gersbach, Charles A.;Barbas, Carlos F., III
通讯作者：
Barbas, Carlos F., III
DOI：
10.1080/21541264.2017.1322170
发表时间：
2017
期刊：
Transcription
影响因子：
--
作者：
Gao Z;Harwig A;Berkhout B;Herrera-Carrillo E
通讯作者：
Herrera-Carrillo E