An enzyme-linked immunosorbent assay-based system for determining the physiological level of poly(ADP-ribose) in cultured cells.
An enzyme-linked immunosorbent assay-based system for determining the physiological level of poly(ADP-ribose) in cultured cells.
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DOI：
10.1016/j.ab.2015.10.014
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发表时间：
2016-02-01
影响因子：
2.9
通讯作者：
Miwa M
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Ida C;Yamashita S;Tsukada M;Sato T;Eguchi T;Tanaka M;Ogata S;Fujii T;Nishi Y;Ikegami S;Moss J;Miwa M
聚 ADP-核糖基化由聚（ADP-核糖）（PAR）聚合酶（PARP）介导，可能参与多种细胞事件，包括染色体稳定性、DNA 修复、转录、细胞死亡和分化。完整细胞中 PAR 的生理水平很难确定，因为 PARP 会快速合成 PAR，并且 PAR 降解酶（包括聚（ADP-核糖）糖水解酶 (PARG) 和 ADP-核糖基水解酶 3）会分解 PAR。 PAR 的人为合成和/或降解可能发生在培养细胞裂解过程中。我们开发了一种灵敏的酶联免疫吸附测定 (ELISA) 来测量培养细胞中 PAR 的生理水平。我们立即灭活了催化 PAR 合成和降解的酶。我们验证了三氯乙酸适用于在细胞裂解过程中灭活 PARP、PARG 和其他参与培养细胞中 PAR 代谢的酶。与用于裂解的三氯乙酸相比，用标准放射免疫沉淀测定缓冲液收获的细胞中的 PAR 水平增加了 450 倍，这可能是因为细胞裂解过程中发生的 DNA 损伤激活了 PARP。该ELISA可用于分析培养细胞中各种生理条件下聚ADP-核糖基化的生物学功能。
PolyADP-ribosylation is mediated by poly(ADP-ribose) (PAR) polymerases (PARPs) and may be involved in various cellular events, including chromosomal stability, DNA repair, transcription, cell death, and differentiation. The physiological level of PAR is difficult to determine in intact cells because of the rapid synthesis of PAR by PARPs and the breakdown of PAR by PAR-degrading enzymes, including poly(ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) and ADP-ribosylhydrolase 3. Artifactual synthesis and/or degradation of PAR likely occurs during lysis of cells in culture. We developed a sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to measure the physiological levels of PAR in cultured cells. We immediately inactivated enzymes that catalyze the synthesis and degradation of PAR. We validated that trichloroacetic acid is suitable for inactivating PARPs, PARG, and other enzymes involved in metabolizing PAR in cultured cells during cell lysis. The PAR level in cells harvested with the standard radioimmunoprecipitation assay buffer was increased by 450-fold compared with trichloroacetic acid for lysis, presumably because of activation of PARPs by DNA damage that occurred during cell lysis. This ELISA can be used to analyze the biological functions of polyADP-ribosylation under various physiological conditions in cultured cells.
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