The Fe-type nitrile hydratase from Rhodococcus equi TG328-2 forms an alpha-activator protein complex
The Fe-type nitrile hydratase from Rhodococcus equi TG328-2 forms an alpha-activator protein complex
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马红球菌 TG328-2 的 Fe 型腈水合酶形成 α 激活蛋白复合物
DOI：
10.1007/s00775-020-01806-y
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发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Holz, Richard C.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Lankathilaka, K. P.;Bennett, Brian;Holz, Richard C.
马红球菌TG 328 -2（Rhodococcus equiTG 328 -2，ReNHase）中发现了一种铁型腈水合酶α（Nitrile hydrataseα，NHase）蛋白复合物，经MALDI-TOF分析表明，该复合物为1：1复合物。分离的α（α）蛋白复合物即使在铁的存在下也没有表现出可检测的腈水合酶活性。将ReNH酶β亚基和Fe（II）加入ReNH酶apo-α（ε）复合物中，以丙烯腈为底物，该酶的akcat值为0.7 ± 0.1 s− 1，表明β亚基对NH酶活性的重建很重要。添加还原剂TCEP使活性提高了50%以上（kcatof 1.7 ± 0.2 s-1）。由于（ε）蛋白先前被证明可以结合并水解GTP，因此在Fe（II）和β亚基存在下，将GTP加入到纯化的α（ε）复合物中可以提供1.1 ± 0.2 s−1的akcat值。在该组合中加入TCEP进一步增强了活性（kcat为2.1 ± 0.3 s-1）。表达纯化的载脂蛋白α-亚基，并将其添加到（α）蛋白和β-亚基中，加上Fe（II）和TCEP，导致akcat值为0.7 ± 0.2 s− 1，表明α（α）复合物可以在体外形成。向该样品中加入GTP使观察到的腈水合速率增加约30%，而不含TCEP的样品没有表现出活性。总之，这些数据为深入了解（α）蛋白和新发现的α（α）复合物在NHase双中心组装中的作用提供了依据。
AbstractAn Fe-type nitrile hydrataseα(ɛ) protein complex fromRhodococcus equiTG328-2 (ReNHase) was discovered and shown by MALDI-TOF to form a 1:1 complex. As isolated, theα(ɛ) protein complex exhibited no detectable NHase activity even in the presence of iron. The addition of theReNHase β-subunit and Fe(II) to theReNHase apo-α(ε) complex, provided an enzyme with akcatvalue of 0.7 ± 0.1 s−1using acrylonitrile as the substrate, indicating that the β-subunit is important for the reconstitution of NHase activity. The addition of the reducing agent TCEP enhanced the activity by more than 50% (kcatof 1.7 ± 0.2 s−1). As the (ɛ) protein was previously shown to bind and hydrolyze GTP, the addition of GTP to the as-purifiedα(ε) complex provided akcatvalue of 1.1 ± 0.2 s−1, in the presence of Fe(II) and β-subunit. The addition of TCEP to this combination further enhanced the activity (kcatof 2.1 ± 0.3 s−1). Apo α-subunit was expressed in purified and added to the (ɛ) protein and β-subunits plus Fe(II) and TCEP resulting in akcatvalue of 0.7 ± 0.2 s−1suggesting anα(ɛ) complex can form in vitro. The addition of GTP to this sample increased the observed rate of nitrile hydration by ~ 30%, while TCEP free samples exhibited no activity. Taken together, these data provide insight into the role of the (ɛ) protein and the newly discoveredα(ɛ) complex in NHase metallocenter assembly.Graphic abstract
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