A guide to nucleic acid detection by single-molecule kinetic fingerprinting.
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DOI：
10.1016/j.ymeth.2018.08.002
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发表时间：
2019-01-15
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Walter NG
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Johnson-Buck A;Li J;Tewari M;Walter NG
检测少量核酸的传统方法需要通过聚合酶链式反应 (PCR) 进行扩增，这需要事先纯化并引入复制错误。虽然免扩增方法没有这些缺点，但它们的灵敏度和特异性通常比基于 PCR 的方法低几个数量级。在这篇综述中，我们提供了一种新型无扩增方法的实用指南，即通过平衡泊松采样进行单分子识别（SiMREPS），该方法通过监测荧光探针与固定靶标的重复相互作用来提供单分子灵敏度和单碱基选择性。我们演示了这种动态指纹识别如何过滤掉由探针不可避免的非特异性结合产生的背景，产生几乎为零的背景信号。作为这种数字检测方法的实际应用，我们提出了 microRNA miR-16 的定量和突变 EGFR L858R 的检测，其明显的单碱基区分因子超过 300 万。
Conventional methods for detecting small quantities of nucleic acids require amplification by the polymerase chain reaction (PCR), which necessitates prior purification and introduces copying errors. While amplification-free methods do not have these shortcomings, they are generally orders of magnitude less sensitive and specific than PCR-based methods. In this review, we provide a practical guide to a novel amplification-free method, single-molecule recognition through equilibrium Poisson sampling (SiMREPS), that provides both single-molecule sensitivity and single-bas e selectivity by monitoring the repetitive interactions of fluorescent probes to immobilized targets. We demonstrate how this kinetic fingerprinting filters out background arising from the inevitable nonspecific binding of probes, yielding virtually zero background signal. As practical applications of this digital detection methodology, we present the quantification of microRNA miR-16 and the detection of the mutation EGFR L858R with an apparent single-base discrimination factor of over 3 million.
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