Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.
Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening.
复制标题
基因组尺度CRISPR-CAS9敲除和转录激活筛选。
DOI：
10.1038/nprot.2017.016
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发表时间：
2017-04
期刊：
影响因子：
14.8
通讯作者：
Zhang F
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Joung J;Konermann S;Gootenberg JS;Abudayyeh OO;Platt RJ;Brigham MD;Sanjana NE;Zhang F
正向遗传筛选是对与感兴趣的表型相关的特定遗传元件进行公正发现和功能表征的强大工具。最近，来自微生物 CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列）免疫系统的 RNA 引导核酸内切酶 Cas9 已通过将 Cas9 与引导 RNA 混合文库相结合，适用于基因组规模的筛选。在这里，我们描述了使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因组规模敲除和转录激活筛选的方案。构建定制或现成的向导RNA文库并将其包装到慢病毒载体中，以递送到细胞中进行筛选。由于每个筛选都是独一无二的，我们提供了确定筛选参数和保持足够覆盖范围的指南。为了验证从筛选中识别出的候选基因，我们进一步描述了通过分析插入缺失率和转录激活来确认筛选表型以及遗传扰动的策略。从文库设计开始，基因组规模的筛选可以在 9-15 周内完成，然后进行 4-5 周的验证。
Forward genetic screens are powerful tools for the unbiased discovery and functional characterization of specific genetic elements associated with a phenotype of interest. Recently, the RNA-guided endonuclease Cas9 from the microbial CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) immune system has been adapted for genome-scale screening by combining Cas9 with pooled guide RNA libraries. Here we describe a protocol for genome-scale knockout and transcriptional activation screening using the CRISPR-Cas9 system. Custom- or ready-made guide RNA libraries are constructed and packaged into lentiviral vectors for delivery into cells for screening. As each screen is unique, we provide guidelines for determining screening parameters and maintaining sufficient coverage. To validate candidate genes identified from the screen, we further describe strategies for confirming the screening phenotype as well as genetic perturbation through analysis of indel rate and transcriptional activation. Beginning with library design, a genome-scale screen can be completed in 9–15 weeks followed by 4–5 weeks of validation.
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影响因子：
48
作者：
Chavez A;Tuttle M;Pruitt BW;Ewen-Campen B;Chari R;Ter-Ovanesyan D;Haque SJ;Cecchi RJ;Kowal EJK;Buchthal J;Housden BE;Perrimon N;Collins JJ;Church G
通讯作者：
Church G
影响因子：
46.9
作者：
Doench JG;Fusi N;Sullender M;Hegde M;Vaimberg EW;Donovan KF;Smith I;Tothova Z;Wilen C;Orchard R;Virgin HW;Listgarten J;Root DE
通讯作者：
Root DE
影响因子：
64.5
作者：
Hsu PD;Lander ES;Zhang F
通讯作者：
Zhang F
影响因子：
46.9
作者：
Evers, Bastiaan;Jastrzebski, Katarzyna;Bernards, Rene
通讯作者：
Bernards, Rene
通过反式编码的小 RNA 和宿主因子 RNase III 进行 CRISPR RNA 成熟。
影响因子：
64.8
作者：
Deltcheva, Elitza;Chylinski, Krzysztof;Sharma, Cynthia M.;Gonzales, Karine;Chao, Yanjie;Pirzada, Zaid A.;Eckert, Maria R.;Vogel, Joerg;Charpentier, Emmanuelle
通讯作者：
Charpentier, Emmanuelle