Probing biomolecular structures and dynamics of single molecules using in-gel alternating-laser excitation.
Probing biomolecular structures and dynamics of single molecules using in-gel alternating-laser excitation.
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DOI：
10.1021/ac901423e
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发表时间：
2009-12-01
影响因子：
7.4
通讯作者：
Kapanidis, Achillefs N.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Santoso, Yusdi;Kapanidis, Achillefs N.
凝胶电泳是用于基于大小和电荷分离生物分子的标准生物化学技术。尽管在早期的单分子实验中使用了凝胶，但凝胶电泳尚未被广泛用于单分子荧光光谱。我们提出了一种新的方法，结合凝胶电泳和单分子荧光光谱同时纯化和分析凝胶基质中的生物分子。我们的方法，在凝胶ALEX，使用非变性凝胶纯化感兴趣的生物分子复合物从游离组分，聚集体，和非特异性复合物。凝胶基质还减缓了分子的平移扩散，产生了长的，高分辨率的时间痕迹，而无需表面固定，这允许在生物友好的环境中扩展构象动力学的观察。我们证明了这种方法与不同类型的单分子光谱技术，包括共聚焦检测和荧光相关光谱的兼容性。我们证明，在凝胶ALEX可用于研究构象动力学在毫秒的时间尺度;通过研究凝胶中的DNA发夹，我们直接观察到荧光波动，由于构象之间的相互转换折叠和未折叠状态。我们的方法适合于添加可以改变系统的平衡和动态特性的小分子。In-gel ALEX将成为研究复杂生物分子及其组装体的结构和动力学的多功能工具。
Gel electrophoresis is a standard biochemical technique used for separating biomolecules on the basis of size and charge. Despite the use of gels in early single-molecule experiments, gel electrophoresis has not been widely adopted for single-molecule fluorescence spectroscopy. We present a novel method that combines gel electrophoresis and single-molecule fluorescence spectroscopy to simultaneously purify and analyze biomolecules in a gel matrix. Our method, in-gel ALEX, uses non-denaturing gels to purify biomolecular complexes of interest from free components, aggregates, and non-specific complexes. The gel matrix also slows down translational diffusion of molecules, giving rise to long, high-resolution time traces without surface immobilization, which allow extended observations of conformational dynamics in a biologically friendly environment. We demonstrated the compatibility of this method with different types of single molecule spectroscopy techniques, including confocal detection and fluorescence-correlation spectroscopy. We demonstrated that in-gel ALEX can be used to study conformational dynamics at the millisecond timescale; by studying a DNA hairpin in gels, we directly observed fluorescence fluctuations due to conformational interconversion between folded and unfolded states. Our method is amenable to the addition of small molecules that can alter the equilibrium and dynamic properties of the system. In-gel ALEX will be a versatile tool for studying structures and dynamics of complex biomolecules and their assemblies.
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影响因子：
14.9
作者：
CHELM, BK;GEIDUSCHEK, EP
通讯作者：
GEIDUSCHEK, EP
DOI：
10.1080/10587259608042727
发表时间：
1996-01-01
影响因子：
--
作者：
Dickson, RM;Norris, DJ;Moerner, WE
通讯作者：
Moerner, WE
影响因子：
3.4
作者：
Margeat, E;Kapanidis, AN;Weiss, S
通讯作者：
Weiss, S
影响因子：
64.8
作者：
Dickson, RM;Cubitt, AB;Moerner, WE
通讯作者：
Moerner, WE
影响因子：
56.9
作者：
Dickson, RM;Norris, DJ;Moerner, WE
通讯作者：
Moerner, WE