Critical Comparison of FRET-Sensor Functionality in the Cytosol and Endoplasmic Reticulum and Implications for Quantification of Ions.
Critical Comparison of FRET-Sensor Functionality in the Cytosol and Endoplasmic Reticulum and Implications for Quantification of Ions.
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DOI：
10.1021/acs.analchem.7b02933
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发表时间：
2017-09-05
影响因子：
7.4
通讯作者：
Palmer AE
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Carter KP;Carpenter MC;Fiedler B;Jimenez R;Palmer AE
基于荧光共振能量转移（FRET）的遗传编码传感器是用于定量和可视化活细胞中的分析物的有力工具，并且当靶向细胞器时，具有限定分析物在细胞的不同部分中的分布的潜力。然而，分析物分布的定量估计需要对不同位置的传感器功能进行严格和系统的分析。在这项工作中，我们建立了方法来严格评估传感器在不同细胞器中的性能，并对三种不同的基因编码传感器平台进行了并排比较，以量化细胞锌离子（Zn2+）。校准条件针对高动态范围和稳定的FRET信号进行了优化。使用单细胞显微镜和能够在几个小时内筛选数千个细胞的新型微流体平台的组合，我们观察到这些传感器在细胞质中的差异性能相比，HeLa细胞的ER，并确定在ER中传感器的氧化低聚物的形成。最后，我们使用新的方法来重新评估这些传感器在试管和活细胞中的结合参数。最终，我们证明传感器响应可能会受到不同细胞环境的影响，并为评估未来几代细胞器靶向传感器提供了框架。
Genetically-encoded sensors based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) are powerful tools for quantifying and visualizing analytes in living cells, and when targeted to organelles have the potential to define distribution of analytes in different parts of the cell. However, quantitative estimates of analyte distribution require rigorous and systematic analysis of sensor functionality in different locations. In this work, we establish methods to critically evaluate sensor performance in different organelles and carry out a side-by-side comparison of three different genetically encoded sensor platforms for quantifying cellular zinc ions (Zn2+). Calibration conditions are optimized for high dynamic range and stable FRET signals. Using a combination of single-cell microscopy and a novel microfluidic platform capable of screening thousands of cells in a few hours, we observe differential performance of these sensors in the cytosol compared to the ER of HeLa cells, and identify the formation of oxidative oligomers of the sensors in the ER. Finally, we use new methodology to re-evaluate the binding parameters of these sensors both in the test tube and in living cells. Ultimately, we demonstrate that sensor responses can be affected by different cellular environments, and provide a framework for evaluating future generations of organelle-targeted sensors.
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影响因子：
4
作者：
Qin Y;Miranda JG;Stoddard CI;Dean KM;Galati DF;Palmer AE
通讯作者：
Palmer AE
液滴微流体流式细胞仪，用于对遗传编码传感器的瞬时细胞反应进行分类。
影响因子：
7.4
作者：
Fiedler BL;Van Buskirk S;Carter KP;Qin Y;Carpenter MC;Palmer AE;Jimenez R
通讯作者：
Jimenez R
影响因子：
3.7
作者：
Lindenburg, Laurens H.;Vinkenborg, Jan L.;Merkx, Maarten
通讯作者：
Merkx, Maarten
影响因子：
3.7
作者：
Miranda JG;Weaver AL;Qin Y;Park JG;Stoddard CI;Lin MZ;Palmer AE
通讯作者：
Palmer AE
影响因子：
4
作者：
Park, J. Genevieve;Qin, Yan;Galati, Domenico F.;Palmer, Amy E.
通讯作者：
Palmer, Amy E.