Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.
Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.
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DOI：
10.3791/52118
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发表时间：
2015-01-03
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Orkin SH
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Bauer DE;Canver MC;Orkin SH
CRISPR/Cas9是一个强大的系统，可以产生基因和遗传元件的破坏。在这里，我们描述了一种使用CRISPR/Cas9在哺乳动物细胞系中有效创建基因组缺失的方案。原核生物聚集规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关（Cas） 9系统可能被重新用于位点特异性真核生物基因组工程。CRISPR/Cas9是一种廉价、简便、高效的基因组编辑工具，可以对基因和遗传元件进行遗传干扰。在这里，我们提出了一种简单的CRISPR设计、克隆和传递基因组缺失的方法。此外，我们还描述了删除、鉴定和表征的技术。该策略依赖于一对嵌合单引导rna （sgRNAs）的细胞递送，在一个位点上产生两条双链断裂（dsb），以便通过非同源末端连接（NHEJ）修复删除中间的DNA片段。与单位点小索引相比，缺失具有潜在的优势，因为它具有双等位基因修饰的效率，易于通过PCR快速鉴定，功能丧失的可预测性，以及对非编码元件的研究的实用性。这种方法可用于有效地研究哺乳动物细胞系中基因和遗传元件的功能丧失。
CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9. The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.
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影响因子：
64.8
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
3.7
作者：
Engler, Carola;Kandzia, Romy;Marillonnet, Sylvestre
通讯作者：
Marillonnet, Sylvestre
DOI：
10.1016/j.tig.2008.08.007
发表时间：
2008-11
期刊：
Trends in genetics : TIG
影响因子：
--
作者：
McVey M;Lee SE
通讯作者：
Lee SE
影响因子：
46.9
作者：
通讯作者：
--
影响因子：
17.3
作者：
Gaj, Thomas;Gersbach, Charles A.;Barbas, Carlos F., III
通讯作者：
Barbas, Carlos F., III