A Novel Proximity Biotinylation Assay Based on the Self-Associating Split GFP1-10/11.
A Novel Proximity Biotinylation Assay Based on the Self-Associating Split GFP1-10/11.
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一种基于自缔约的分裂GFP1-10/11的新型接近生物素化测定法。
DOI：
10.3390/proteomes8040037
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发表时间：
2020-12-02
期刊：
影响因子：
3.3
通讯作者：
LaCount DJ
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Kesari AS;Aryal UK;LaCount DJ
邻近生物素化的开发是为了检测活细胞中生理相关的蛋白质-蛋白质相互作用。在这种方法中，目标蛋白质被标记为混杂的生物素连接酶，例如 BioID 或 BioID2，它产生与附近蛋白质反应的活化生物素；随后可以通过质谱法纯化和鉴定这些蛋白质。在这里，我们报告了对该技术的一种新颖修改，将其与自缔合 split-GFP 系统相结合，在该系统中，我们利用 GFP1-10 和 GFP11 之间的高亲和力相互作用将 BioID2 招募到感兴趣的蛋白质上。作为测试案例，我们将 GFP11 与网格蛋白轻链 (CLTB) 融合，将 BioID2 与 GFP1-10 融合。 GFP11-CLTB 和 BioID2-GFP1-10 的共表达产生了与网格蛋白重链共定位的绿色荧光复合物。为了促进非特异性生物素化蛋白质的去除，我们生成了表达 BioID2-GFP1–10 的诱导细胞系。与 BioID2 与 CLTB 直接融合相比，该细胞系中 GFP11-CLTB 的邻近生物素化产生了更高百分比的生物学相关相互作用。因此，该系统可用于监测 BioID 诱饵蛋白的表达和定位，并识别蛋白质-蛋白质相互作用。
Proximity biotinylation was developed to detect physiologically relevant protein–protein interactions in living cells. In this method, the protein of interest is tagged with a promiscuous biotin ligase, such as BioID or BioID2, which produces activated biotin that reacts with nearby proteins; these proteins can subsequently be purified and identified by mass spectrometry. Here we report a novel modification of this technique by combining it with a self-associating split-GFP system in which we exploit the high-affinity interaction between GFP1–10 and GFP11 to recruit BioID2 to the protein of interest. As a test case, we fused GFP11 to clathrin light chain (CLTB) and BioID2 to GFP1–10. Co-expression of GFP11-CLTB and BioID2-GFP1–10 yielded a green fluorescent complex that co-localized with clathrin heavy chain. To facilitate removal of non-specifically biotinylated proteins, we generated an inducible cell line expressing BioID2-GFP1–10. Proximity biotinylation in this cell line with GFP11-CLTB yielded a higher percentage of biologically relevant interactions than direct fusion of BioID2 to CLTB. Thus, this system can be used to monitor expression and localization of BioID bait proteins and to identify protein–protein interactions.
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DOI：
10.1083/jcb.201112098
发表时间：
2012-03-19
期刊：
The Journal of cell biology
影响因子：
--
作者：
Roux KJ;Kim DI;Raida M;Burke B
通讯作者：
Burke B
影响因子：
14.9
作者：
The Gene Ontology Consortium
通讯作者：
The Gene Ontology Consortium
影响因子：
4
作者：
Schwinn, Marie K.;Machleidt, Thomas;Wood, Keith V.
通讯作者：
Wood, Keith V.
DOI：
10.1007/978-1-4939-6747-6_10
发表时间：
2017-01-01
期刊：
PROTEOMICS: METHODS AND PROTOCOLS
影响因子：
--
作者：
Hesketh, Geoffrey G.;Youn, Ji-Young;Gingras, Anne-Claude
通讯作者：
Gingras, Anne-Claude
影响因子：
46.9
作者：
Cabantous, S;Terwilliger, TC;Waldo, GS
通讯作者：
Waldo, GS