Optimization of the production of gurmarin, a sweet-taste-suppressing protein, secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris
Optimization of the production of gurmarin, a sweet-taste-suppressing protein, secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris
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甲基营养酵母毕赤酵母分泌的古马林（一种甜味抑制蛋白）生产的优化
DOI：
10.1007/s00253-012-3897-3
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发表时间：
--
影响因子：
5
通讯作者：
Briand L
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Sigoillot M;Brockhoff A;Lescop E;Poirier N;Meyerhof W;Briand L
Gumarin 是一种 35 个残基的多肽，已知可选择性抑制啮齿动物对甜味物质的反应，而不影响对其他基本味觉刺激（例如 NaCl、HCl 和奎宁）的反应。在这里，我们报告了使用甲基营养酵母巴斯德毕赤酵母异源表达古马林。使用不含酿酒酵母 EAEA 间隔肽的 α 因子前原序列，将古马林分泌到缓冲基本培养基中，并处于甲醇诱导型醇氧化酶启动子的控制之下。我们发现，在 4 天的表达期内，古尔马林在酵母培养基中的积累达到每升培养物 5 毫克。为了比较生产水平和信号肽加工，古尔马林的 N 末端氨基酸被谷氨酸残基取代。该构建体导致古尔马林分泌水平增加 6 倍，从而每升培养物产生 30 毫克纯化蛋白。使用质谱法对两种构建体产生的纯化重组古马林进行表征。圆二色性和核磁共振波谱显示重组古尔马林正确折叠并具有二级和三级结构。我们还通过在人胚肾 HEK293T 细胞中的功能表达证实了其抑制大鼠异二聚体甜味 T1R2/T1R3 受体的能力。在 P 中获得高水平的完全活性古马素。巴斯德酵母使该表达系统对发酵罐生长以及味觉受体和古马林功能的药理学研究具有吸引力。
Gurmarin, a 35-residue polypeptide, is known to selectively inhibit responses to sweet substances in rodents without affecting responses to other basic taste stimuli, such as NaCl, HCl, and quinine. Here, we report the heterologous expression of gurmarin using the methylotrophic yeastPichia pastoris. Gurmarin was secreted into the buffered minimal medium using the α-factor preprosequence without the EAEA spacer peptide ofSaccharomyces cerevisiaeand was under the control of the methanol-inducible alcohol oxidase promoter. We found that gurmarin accumulated in the yeast culture medium reaching 5 mg per liter of culture over an expression period of 4 days. To compare the production level and the signal peptide processing, the N-terminal amino acid of gurmarin was substituted by a glutamic acid residue. This construct resulted in a 6-fold increase in the level of gurmarin secretion leading to 30 mg of purified protein per liter of culture. Purified recombinant gurmarin resulting from both constructs was characterized using mass spectrometry. Circular dichroism and NMR spectroscopy revealed that recombinant gurmarin was properly folded and had secondary and tertiary structures. We also confirmed its capability to inhibit the rat heterodimeric sweet taste T1R2/T1R3 receptor by functional expression in human embryonic kidney HEK293T cells. The high level of fully active gurmarin obtained inP. pastorismakes this expression system attractive for fermentor growth and pharmacological investigations of taste receptor and gurmarin functions.
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