Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry.
Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry.
复制标题
DOI：
10.3791/54402
复制
发表时间：
2016-09-20
期刊：
影响因子：
--
通讯作者：
Miyaguchi H
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Miyaguchi H
介绍了一种改进的聚合酶链反应（PCR）-限制性片段长度多态性（RFLP）液相色谱/电喷雾电离质谱（LC/ESI-MS）法对河豚毒素进行基因分型的方法。使用基于二氧化硅膜的DNA提取试剂盒进行DNA提取。使用不含洗涤剂的PCR缓冲液进行PCR扩增后，在不纯化反应溶液的情况下向溶液中添加限制性酶。采用反相硅胶整体柱和具有改进的Kingdon阱分析器的傅里叶变换高分辨率质谱仪分别用于分离和检测。移动的流动相由400 mM 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇、15 mM三乙胺（pH 7.9）和甲醇组成，以0.4 ml/min的流速输送。LC/ESI-MS分析的循环时间为8 min，包括色谱柱平衡。使用具有寡核苷酸的同位素分布模型的去卷积软件从质谱计算相应的单一同位素质量。对于寡核苷酸（范围26-79个核苷酸）的分析，质量准确度为0.62 ± 0.74 ppm（n = 280），并且在不使用锁定质量标准品的情况下保持了180小时的出色准确度和精密度。
An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry (LC/ESI-MS) is described. DNA extraction is carried out using a silica membrane-based DNA extraction kit. After the PCR amplification using a detergent-free PCR buffer, restriction enzymes are added to the solution without purifying the reaction solution. A reverse-phase silica monolith column and a Fourier transform high resolution mass spectrometer having a modified Kingdon trap analyzer are employed for separation and detection, respectively. The mobile phase, consisting of 400 mM 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, 15 mM triethylamine (pH 7.9) and methanol, is delivered at a flow rate of 0.4 ml/min. The cycle time for LC/ESI-MS analysis is 8 min including equilibration of the column. Deconvolution software having an isotope distribution model of the oligonucleotide is used to calculate the corresponding monoisotopic mass from the mass spectrum. For analysis of oligonucleotides (range 26-79 nucleotides), mass accuracy was 0.62 ± 0.74 ppm (n = 280) and excellent accuracy and precision were sustained for 180 hr without use of a lock mass standard.
登录
查看更多内容
影响因子：
5.1
作者：
Cummins, LL;Chen, S;Hofstadler, SA
通讯作者：
Hofstadler, SA
影响因子：
4.3
作者：
Beer, Beate;Erb, Robert;Oberacher, Herbert
通讯作者：
Oberacher, Herbert
影响因子：
3.1
作者：
Kiesler, Kevin M.;Coble, Michael D.;Vallone, Peter M.
通讯作者：
Vallone, Peter M.
影响因子：
2
作者：
Manduzio, Helene;Ezan, Eric;Fenaille, Francois
通讯作者：
Fenaille, Francois
影响因子：
2
作者：
Null, AP;Muddiman, DC
通讯作者：
Muddiman, DC