Use of (32)P to study dynamics of the mitochondrial phosphoproteome.
Use of (32)P to study dynamics of the mitochondrial phosphoproteome.
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DOI：
10.1021/pr800913j
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发表时间：
2009-06
影响因子：
4.4
通讯作者：
Balaban, Robert S.
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Aponte, Angel M.;Phillips, Darci;Hopper, Rachel K.;Johnson, D. Thor;Harris, Robert A.;Blinova, Ksenia;Boja, Emily S.;French, Stephanie;Balaban, Robert S.
关键词：
蛋白质磷酸化是细胞质中一种已被充分表征的调节机制，但在线粒体中仍不清楚。在这项研究中，我们利用 32P 标记来监测心脏和肝脏线粒体基质中蛋白质磷酸化的周转。将 32P 标记技术与 Phos-tag 蛋白磷酸化荧光染色和 2D 等电聚焦技术进行比较和对比。在 Phos-Tag 凝胶中 MS 光谱鉴定出的 64 种蛋白质中，超过 20 种蛋白质与 32P 标记相关。 32P 掺入的高灵敏度检测到的蛋白质远低于质谱甚至 2D 凝胶蛋白质的检测限。磷酸盐追踪实验揭示了周转率和磷酸盐相关的蛋白质库大小的变化取决于初始孵育条件。使用非破坏性天然凝胶观察到广泛的弱磷酸盐/磷酸盐代谢物相互作用，提供了一种筛选磷酸盐代谢物与基质蛋白的潜在变构相互作用的新方法。我们确认了复合物 V 和 I 中的磷酸盐关联，因为它们在氧化磷酸化中发挥着关键作用，并验证了 2D 方法。在完整线粒体中进行 32P 标记后，通过免疫捕获分离这些复合物，并揭示了复合物 V 中的 α、β、γ、OSCP 和 d 亚基以及复合物 I 中的 75kDa、51kDa、42kDa、23kDa 和 13a kDa 亚基的 32P 掺入。这些结果表明，动态且广泛的线粒体 基质磷酸蛋白质组存在于心脏和肝脏中。
Protein phosphorylation is a well characterized regulatory mechanism in the cytosol, but remains poorly defined in the mitochondrion. In this study, we characterized the use of 32P-labeling to monitor the turnover of protein phosphorylation in the heart and liver mitochondria matrix. The 32P labeling technique was compared and contrasted to Phos-tag protein phosphorylation fluorescent stain and 2D isoelectric focusing. Of the 64 proteins identified by MS spectroscopy in the Phos-Tag gels, over 20 proteins were correlated with 32P labeling. The high sensitivity of 32P incorporation detected proteins well below the mass spectrometry and even 2D gel protein detection limits. Phosphate-chase experiments revealed both turnover and phosphate associated protein pool size alterations dependent on initial incubation conditions. Extensive weak phosphate/phosphate metabolite interactions were observed using non-disruptive native gels, providing a novel approach to screen for potential allosteric interactions of phosphate metabolites with matrix proteins. We confirmed the phosphate associations in Complexes V and I due to their critical role in oxidative phosphorylation and to validate the 2D methods. These complexes were isolated by immunocapture, after 32P labeling in the intact mitochondria, and revealed 32P-incorporation for the α, β, γ, OSCP, and d subunits in Complex V and the 75kDa, 51kDa, 42kDa, 23kDa, and 13a kDa subunits in Complex I. These results demonstrate that a dynamic and extensive mitochondrial matrix phosphoproteome exists in heart and liver.
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