Use of single guided Cas9 nickase to facilitate precise and efficient genome editing in human iPSCs.
Use of single guided Cas9 nickase to facilitate precise and efficient genome editing in human iPSCs.
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使用单导向Cas9切口酶促进人iPSC中精确和有效的基因组编辑。
DOI：
10.1038/s41598-021-89312-2
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发表时间：
2021-05-10
影响因子：
4.6
通讯作者：
Margolis RL
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Li PP;Margolis RL
Cas9核酸酶可以快速高效地产生经过基因编辑的细胞系。然而，在典型的方案中，突变被故意引入到供体模板中，以避免供体模板的裂解或成功编辑的等位基因的重新裂解，从而损害所产生的等基因系的保真度。此外，用于编辑的双链断裂(DSB)可以通过非同源末端连接(NHEJ)在成功修饰的细胞的第二个等位基因中引入不希望的“靶向”插入。为了解决这些问题，我们提出了一种优化的方案，用于在人的IPSCs中进行精确的基因组编辑，该方案使用(1)单引导Cas9镍酶产生单链断裂(SSB)，(2)瞬时过表达bclxl来提高电穿孔后的存活率，以及(3)使用iggyBac转座子系统来无缝去除双重选择标记。我们用这种方法修改了PPP2R2B外显子7中CAG重复序列的长度。当超过43个三胞胎时，这种重复导致神经退行性疾病脊髓小脑性共济失调12型(SCA12)；我们的目标是无缝地将SCA12突变引入人类对照IPSC系。在我们的方案中，选择的 ~ 克隆中有15%的克隆具有所需的基因编辑，没有目标上的插入或目标外的改变，也没有通过供体模板故意引入突变。这种方法将允许精确和有效地编辑用于疾病建模和其他目的的人类IPSCs。
Cas9 nucleases permit rapid and efficient generation of gene-edited cell lines. However, in typical protocols, mutations are intentionally introduced into the donor template to avoid the cleavage of donor template or re-cleavage of the successfully edited allele, compromising the fidelity of the isogenic lines generated. In addition, the double-stranded breaks (DSBs) used for editing can introduce undesirable “on-target” indels within the second allele of successfully modified cells via non-homologous end joining (NHEJ). To address these problems, we present an optimized protocol for precise genome editing in human iPSCs that employs (1) single guided Cas9 nickase to generate single-stranded breaks (SSBs), (2) transient overexpression of BCL-XL to enhance survival post electroporation, and (3) the PiggyBac transposon system for seamless removal of dual selection markers. We have used this method to modify the length of the CAG repeat contained in exon 7 of PPP2R2B. When longer than 43 triplets, this repeat causes the neurodegenerative disorder spinocerebellar ataxia type 12 (SCA12); our goal was to seamlessly introduce the SCA12 mutation into a human control iPSC line. With our protocol, ~ 15% of iPSC clones selected had the desired gene editing without “on target” indels or off-target changes, and without the deliberate introduction of mutations via the donor template. This method will allow for the precise and efficient editing of human iPSCs for disease modeling and other purposes.
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通过瞬时 BCL-XL 过表达，在人类多能干细胞中通过 CRISPR-Cas9 实现高效基因组编辑
影响因子：
14.9
作者：
Li XL;Li GH;Fu J;Fu YW;Zhang L;Chen W;Arakaki C;Zhang JP;Wen W;Zhao M;Chen WV;Botimer GD;Baylink D;Aranda L;Choi H;Bechar R;Talbot P;Sun CK;Cheng T;Zhang XB
通讯作者：
Zhang XB
影响因子：
7
作者：
Nakajima K;Zhou Y;Tomita A;Hirade Y;Gurumurthy CB;Nakada S
通讯作者：
Nakada S
影响因子：
14.9
作者：
Brinkman EK;Chen T;Amendola M;van Steensel B
通讯作者：
van Steensel B
影响因子：
4.6
作者：
Satomura A;Nishioka R;Mori H;Sato K;Kuroda K;Ueda M
通讯作者：
Ueda M
DOI：
10.1073/pnas.1305987110
发表时间：
2013-06-18
影响因子：
11.1
作者：
Li, Xianghong;Burnight, Erin R.;Craig, Nancy L.
通讯作者：
Craig, Nancy L.