A Combinatorial G Protein-coupled Receptor Reconstitution System on Budded Baculovirus
A Combinatorial G Protein-coupled Receptor Reconstitution System on Budded Baculovirus
复制标题
芽生杆状病毒组合 G 蛋白偶联受体重建系统
DOI：
--
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发表时间：
2003
影响因子：
4.8
通讯作者：
T. Hamakubo
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
K. Masuda;H. Itoh;T. Sakihama;Chiyuki Akiyama;Kazuaki Takahashi;R. Fukuda;T. Yokomizo;Takao Shimizu;T. Kodama;T. Hamakubo
为了研究G蛋白和G蛋白偶联受体（GPCR）的偶联选择性，我们开发了一种由GPCR和胞外杆状病毒颗粒（芽生病毒（BV））上的异源三聚体G蛋白组成的重建系统。感染编码人白三烯 B4 受体 (BLT1) cDNA 的重组杆状病毒的 Sf9 细胞释放的 BV 表现出高水平的 BLT1 表达（27.3 pmol/mg 蛋白质）和特异的 [3H]白三烯 B4 结合活性（Kd = 3.67 nm）。所表达的 BLT1 的明显低亲和力被认为是由于 BV 中与 BLT1 偶联的 Gαi 同工型相对不可用。异源三聚体 G 蛋白重组病毒的共感染导致 BLT1 和 G 蛋白亚基在 BV 上共表达。在共表达 Gαi1β1γ2 (Kd = 0.17 nm) 的 BLT1 BV 中观察到鸟苷-5'-(β,γ-亚氨基)三磷酸敏感的高亲和力配体结合。在共表达 BV 级分中回收了相对大量的高亲和力受体蛋白（6.81 pmol/mg 蛋白）。没有 Gβ1γ2 的 BLT1 和 Gαi1 组合在 BV 上没有表现出高亲和力配体结合，表明该 BV 重建系统中 GPCR-G 蛋白偶联的背景环境较低。为了测试其他 G 蛋白的偶联情况，各种 Gα 亚基在 BV 中与 BLT1 和 Gβ1γ2 组合表达。共表达 GαoAβ1γ2 的 BLT1 BV 表现出相对高亲和力的配体结合以及配体刺激的鸟苷 5'-3-O-(硫代)三磷酸与 Gαi1β1γ2 的结合。其他 Gα 同工型（例如 Gαs、Gα11、Gα14、Gα16、Gα12 或 Gα13）的共表达对该系统中的配体结合亲和力没有表现出任何显着影响。这些结果表明，BLT1 和偶联的三聚体 G 蛋白在 BV 上进行功能重建，并且 Gαo 和 Gαi 与 BLT1 偶联。该表达系统对于药理学表征、生物传感器芯片应用以及针对膜受体蛋白非常重要的靶标的药物发现非常有用。
To investigate the coupling selectivity of G proteins and G protein-coupled receptors (GPCRs), we developed a reconstitution system made up of GPCR and heterotrimeric G proteins on extracellular baculovirus particles (budded virus (BV)). BV released from Sf9 cells infected with a recombinant baculovirus coding for human leukotriene B4 receptor (BLT1) cDNA exhibited a high level of BLT1 expression (27.3 pmol/mg of protein) and specific [3H]leukotriene B4 binding activity (Kd = 3.67 nm). The apparent low affinity of the expressed BLT1 is thought to be due to relative non-availability of the Gαi isoform, which couples to BLT1, in BV. Co-infection of heterotrimeric G protein recombinant viruses led to co-expression of BLT1 and G protein subunits on BV. A guanosine-5′-(β,γ-imido)triphosphate-sensitive, high affinity ligand binding was observed in the BLT1 BV co-expressing Gαi1β1γ2 (Kd = 0.17 nm). A relatively large amount of high affinity receptor protein was recovered in the co-expressing BV fraction (6.81 pmol/mg of protein). A combination of BLT1 and Gαi1 without Gβ1γ2 did not exhibit high affinity ligand binding on BV, indicating the low background environment for the GPCR-G protein coupling in this BV reconstitution system. To test other G proteins for coupling, various Gα subunits were combinatorially expressed in BV with BLT1 and Gβ1γ2. The BLT1 BV co-expressing GαoAβ1γ2 exhibited a comparably high affinity ligand binding as well as ligand-stimulated guanosine 5′-3-O-(thio)triphosphate binding to Gαi1β1γ2. Co-expression of other Gα isoforms such as Gαs, Gα11, Gα14, Gα16, Gα12, or Gα13 did not exhibit any significant effects on ligand binding affinity in this system. These results reveal that BLT1 and coupled trimeric G proteins were functionally reconstituted on BV and that Gαo as well as Gαi couples to BLT1. This expression system should prove highly useful for pharmacological characterization, biosensor chip applications, and also drug discovery directed at highly important targets of the membrane receptor proteins.
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