A continuous, fluorescent, high-throughput assay for human dimethylarginine dimethylaminohydrolase-1.
A continuous, fluorescent, high-throughput assay for human dimethylarginine dimethylaminohydrolase-1.
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DOI：
10.1177/1087057111417712
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发表时间：
2011-10
影响因子：
--
通讯作者：
Fast W
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Linsky T;Fast W
人二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶-1（DDAH-1）的抑制剂对于控制病理性一氧化氮产生具有治疗意义。只有有限数量的生物学上有用的抑制剂已被确定，所以结构多样的先导化合物是理想的。与先前不具有用于最佳筛选的足够灵敏度的测定相比，本文报道了一种高通量测定，其使用替代的硫醇释放底物S-甲基-L-硫代瓜氨酸和硫醇反应性荧光团7-二乙基氨基-3-（4′-马来酰亚胺基苯基）-4-甲基香豆素，以使得能够连续检测DDAH-1的产物形成。应用该测定法查询两个商业文库，总共4，446种化合物，并描述了两个代表性命中，包括已知的DDAH-1抑制剂。这是迄今为止报道的最灵敏的DDAH-1测定，并且能够使用[S] =KM条件筛选化合物文库，同时显示0.6 - 0.8的Z′因子。因此，这种策略现在使得高通量筛选人类DDAH-1抑制剂成为可能，以寻求分子探针和药物来控制过量的一氧化氮产生。
Inhibitors of human dimethylarginine dimethylaminohydrolase-1 (DDAH-1) are of therapeutic interest for controlling pathological nitric oxide production. Only a limited number of biologically useful inhibitors have been identified, so structurally diverse lead compounds are desired. In contrast with previous assays that do not possesses adequate sensitivity for optimal screening, herein is reported a high-throughput assay that uses an alternative thiol-releasing substrate, S-methyl-L-thiocitrulline, and a thiol-reactive fluorophore, 7-diethylamino-3-(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin, to enable continuous detection of product formation by DDAH-1. The assay is applied to query two commercial libraries totaling 4,446 compounds and two representative hits are described, including a known DDAH-1 inhibitor. This is the most sensitive DDAH-1 assay reported to date, and enables screening of compound libraries using [S] =KM conditions, while displaying Z′ factors from 0.6 – 0.8. Therefore, this strategy now makes possible high-throughput screening for human DDAH-1 inhibitors in pursuit of molecular probes and drugs to control excessive nitric oxide production.
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