In vitro genetic reconstruction of bacterial transcription initiation by coupled synthesis and detection of RNA polymerase holoenzyme.
In vitro genetic reconstruction of bacterial transcription initiation by coupled synthesis and detection of RNA polymerase holoenzyme.
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DOI：
10.1093/nar/gkq377
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发表时间：
2010-07
影响因子：
14.9
通讯作者：
Chong S
中科院分区：
文献类型：
--
作者：
Asahara H;Chong S
生物复合物或过程的体外重构通常涉及多个单独纯化的蛋白质组分的组装。在这里，我们提出了一种策略，在体外重组蛋白质合成系统中，多个基因产物的表达和组装与功能检测相结合。该策略潜在地允许仅使用DNA模板而不是纯化的蛋白质来实验性地重建多组分生物复合物或过程。我们将这种策略应用于细菌的转录起始，通过共表达编码大肠杆菌RNA聚合酶亚基和sigma因子的基因，并通过将功能性RNA聚合酶全酶的合成和组装与报告基因的表达偶联。使用这样的系统，我们证明了σ因子依赖性，启动子特异性转录起始。由于蛋白质合成、复合物形成和酶催化发生在相同的体外反应混合物中，因此这种重建过程类似于天然生物合成途径，并且避免了耗时的单个蛋白质的表达和纯化。该策略可以显著减少常规重建方法通常所需的时间，允许快速生成和检测基因突变，并为复杂生物过程的体外研究和干预提供开放和可设计的平台。
In vitro reconstitution of a biological complex or process normally involves assembly of multiple individually purified protein components. Here we present a strategy that couples expression and assembly of multiple gene products with functional detection in an in vitro reconstituted protein synthesis system. The strategy potentially allows experimental reconstruction of a multi-component biological complex or process using only DNA templates instead of purified proteins. We applied this strategy to bacterial transcription initiation by co-expressing genes encoding Escherichia coli RNA polymerase subunits and sigma factors in the reconstituted protein synthesis system and by coupling the synthesis and assembly of a functional RNA polymerase holoenzyme with the expression of a reporter gene. Using such a system, we demonstrated sigma-factor-dependent, promoter-specific transcription initiation. Since protein synthesis, complex formation and enzyme catalysis occur in the same in vitro reaction mixture, this reconstruction process resembles natural biosynthetic pathways and avoids time-consuming expression and purification of individual proteins. The strategy can significantly reduce the time normally required by conventional reconstitution methods, allow rapid generation and detection of genetic mutations, and provide an open and designable platform for in vitro study and intervention of complex biological processes.
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影响因子：
2.9
作者：
Kozlov, M;Bergendahl, V;Mustaev, A
通讯作者：
Mustaev, A
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4.8
作者：
Kuznedelov, Konstantin;Severinov, Konstantin
通讯作者：
Severinov, Konstantin
DOI：
10.1073/pnas.0803106105
发表时间：
2008-07-29
影响因子：
11.1
作者：
Maki, Kimika;Uno, Kanako;Aiba, Hiroji
通讯作者：
Aiba, Hiroji
DOI：
10.1073/pnas.82.6.1648
发表时间：
1985-01-01
影响因子：
11.1
作者：
GANOZA, MC;CUNNINGHAM, C;GREEN, RM
通讯作者：
GREEN, RM
对体外系统中蛋白质合成的比较研究：从原核生物重构为基于真核生物提取物。
影响因子：
3.5
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Hillebrecht, Jason R.;Chong, Shaorong
通讯作者：
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